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Alcuni argomenti trattati sono disponibili in formato PowerPoint al seguente indirizzo web:
www.unipv.it/tslmra22
I recettori a sette domini transmembrana
Forme di Signaling Cellulare
(A) Gli ormoni prodotti dalle ghiandole endocrine sono secreti nel flusso sanguigno e possono essere distribuiti all’intero organismo. (B) I messaggeri paracrini sono rilasciati dalle cellule nel mezzo extracellulare e possono diffondere e agire localmente. (C) I segnali nervosi sono trasmessi lungo gli assoni a cellule bersaglio remote. (D) Il signaling contatto-dipendente richiede che le cellule siano a contatto l’una con l’altra membrana contro membrana. Le differenze cruciali tra le varie modalità riguardano la velocità e la selettività con cui I segnali sono trasmessi alle cellule bersaglio.
(A) ENDOCRINO (B) PARACRINO
(C) NEUROCRINO (D) CONTATTO-DIPENDENTE
cellula endocrina
Flusso sanguigno
recettore
cellula bersaglio
ormonecellule
bersaglio
mediatore locale
cellula segnalatrice
neuronesinapsi
cellula bersagliocorpo
cellulare
assone
neurotrasmetttore
cellula segnalatrice
cellula bersaglio
messaggero legato alla membrana
Trasduzione del Segnale da Recettori di Superfice
ormone citochina
fattore dicrescita
recettore accoppiatoa proteina G
recettore tirosin chinasi
recettore per le citochine
via dell’AMPc
via dell’IP3 via del PI 3-kinasi
via delle MAP kinasi
via del JAK-STAT
recettore
tsqiG proteina
cAMPCa2+
messaggerointracellulare
enzimacanale effettore
Signalling mediante recettori accoppiati a proteine G
Regioni Idrofobiche e idrofiliche dei lipidi di membrana
Lipide di membrana Idrofobico + Idrofilico = Anfipatico
Glicerofosfolipide
Sfingomielina
Glicosfingolipide
Colesterolo
Diacilglicerolo
Ceramide
Ceramide
Anelli idrocarburici
Alcool fosforilato
Fosforilcolina
Residui glucidici
Gruppo OH di C3
Glicerofosfolipide
Glicosfingolipide
Colesterolo
Lipidi di Membranasemplice organizzazione di molecole anfipatiche
Lipidi di MembranaSezione di un bilayer di glicerofosfolipidi
idrofilico
idrofobico
Tutte le membrane biologiche sono bilayers lipidici
Le proteine conferiscono proprietà uniche a ciascun tipo di membrana
Proteine Acilate e Prenilate
acido grasso legato mediante legame estere a una Cys; aggiunto in fase post-traslazionale
Esempi: recettore per l’insulinarecettore beta-adrenergicorodopsina
Acido palmitico
Isoprenoide (farnesil;geranilgeranil)
Isoprenoide legato mediante legame tioetere a una Cys vicina all’estremità C-terminale; aggiunto in fase post-traslazionale
Esempio: subunutà di proteina G (membrana plasmatica)
Acido miristico
acido grasso legato mediante legame amidico a una Gly; aggiunto in fase co-traslazionaleEsempio: subunutà di proteina G (membrana plasmatica)
I Recettori Accoppiati a Proteine G (GPCR) rappresentano una famiglia di > 1000 membri strutturalmente correlati. Queste proteine sono anche chiamate Recettori a 7 Domini Transmembrana.
Recettori accoppiati a proteine G (GPCR)
siti di glicosilazione (legame tramite Asn)
siti di fosforilazione
ancoraggio lipidico citosol
extracell.
Recettori Accoppiati a Proteine G
1. Hanno tutti 7 domini transmembrana (ad es. rodopsina)
2. Ci sono circa 1000 GPCRs nel genoma. (di molti di essi non si conosce ancora il ligando)
3. I singoli recettori rispondono a: un neurotrasmettitore come la serotonina o la dopamina,
una piccola proteina (8-40 amminoacidi, un “peptide”) come le endorfine
uno stimolo olfattorio
la luce, nell’occhio
Caratteristiche generali dei GPCRs comprendono: domini transmembrana ad -elica, ancoraggio ai lipidi che ne stabilizza la conformazione, siti di fosforilazione citosolici che ne regolano l’attività, e siti di glicosilazione extracellulare che permettono l’interazione con molecole extracellulari e altre cellule.
Struttura Generale dei Recettori a 7 DTsiti di glicosilazione (legame tramite Asn) extracell.
citosol
ancoraggio lipidico
siti di fosforilazione
dominio transmembrana
Rodopsina PDB 1F88
La Rodopsina è stato il primo membro della famiglia dei recettori a 7 DT ad avere la sua struttura determinata mediante cristallografia ai raggi-x
Gli effetti di queste interazioni includono alterata affinità per il ligando, dimerizzazione del recettore che può aumentarne o alterarne l’attività, alterata localizzazione del recettore, ecc.
Varie proteine interagiscono con I GPCR o Recettori a 7-DT
per modularne l’attività
RUOLO DELLA -ARRESTINA NELLA REGOLAZIONE DEI RECETTORI ACCOPPIATI A G-PROTEINE
legame del messaggero
fosforilazione del recettore
interazione con -ARR associazione con
CLATRINAFormaazione della vescicola endocitosi
1. Dopo un certo tempo che si è stabilito il legame dell’agonista al GPCR, una kinasi (GRK) fosforila alcuni residui aminoacidici intracellulari del recettore;
2. La fosforilazione porta a un disaccoppiamento del GPCR dalla G proteina (desensitizzazione) e al reclutamento della -arrestina;
3. La -arrestina a sua volta recluta molecole di clatrina;
4. Le molecole di clatrina favoriscono la formazione di una cavità da cui originerà la vescicola
5. La successiva endocitosi della vescicola provocherà l’internalizzazione del recettore.
Recettore di classe A
Recettore di classe B
Le Proprietà dell’Internalizzazione definiscono due classi di GPCRs.
Nel caso dei recettori di classe A (-Adre), l’interazione -arrestina–GPCR è transitoria, e la -arrestina non si localizza con i GPCR negli endosomi. Per i recettori di classe B (Vaso2), l’interazione -arrestina–GPCR è più stabile, e recettore e –arrestina co-localizzano negli endosomi.
Traffico Cellulare della arr2-GFP con i Recettori 2AR (adre) e V2R (vasopr)
Assenza di agonista, la arr2-GFP era omogeneamente distribuita nel citoplasma delle cellule che esprimevano 2AR o V2R. (0 min)
Aggiunta di agonista, viene promossa la rapida redistribuzione dal citosol alla membrana plasmatica. (2 min)
Una esposizione piu prolungata all’ agonista produceva una marcata differenza nel traffico della arr2-GFP (15 min):
2AR : rimaneva nella membrana plasmatica (A)
V2R : nell’arco di 2-3 min, finisce nellevescicole endocitotiche (B)
Cellule HEK-293
Co-transfettate con un plasmide contenente il cDNA per arr2-GFP e il cDNA per ciscun recettore
Per visualizzare la arr2-GFP fluorescente in cellule prima e dopo il trattamento con agonista (10M Isoproterenol, 100nM AVP)
adre
nva
sop
r
Colocalizzazione della arr2-GFP con i Recettori 2AR e V2R internalizzati
Cellule HEK-293
Co-transfettate con arr2-GFP e ciascun recettore
Pre-marcate con rodamina-conj. Anticorpo che marca I recettori
trattate per 15 min a 37C con l’agonista (10M Isoproterenol, 100nM AVP)
visualizzazione al confocale del recettore (rosso) e della arr2-GFP (verde) nelle stesse cellule. Colocalizzazione (giallo) del recettore con la arr2-GFP
V2R : estesa colocalizzazione 2AR : nessuna colocalizzazione
I recettori 2AR e V2R reclutano arrestin con un meccanismo comune durante le fasi iniziali, ma poi c’è divergenza. Il complesso arrestin- 2AR si dissocia a livello della membrana. arrestin-V2AR viene intenalizzato in vescicole endocitotiche.
adre
nva
sop
r
esterno
interno
GTP
GDP + Pi
Il neurotrasmettitore o l’ormone si lega al recettore
Attiva unaG proteina
Risposta
Effettore: enzima o canale
Recettori accoppiati a proteine GQuanto veloce?da 100 ms a 10 s
Quanto lontano?probabilmente <1 m