Post on 01-May-2015
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Alessia StellAdriana Maggi Lab
2 Dicembre 2010
Ingegneria animale e animali transgenici
Manipolazione genetica tradizionale
Manipolazione genetica moderna – DNA RICOMBINANTE
Cosa mancava per passare dalla manipolazione genetica
tradizionale a quella moderna?
1967:Scoperta della DNA ligasi
1968:Scoperta degli enzimi di
restrizione
1972:Avanzamenti nelle tecniche di trasferimento del DNA e
nell’uso di plasmidi
Animale Transgenico:animale nel cui genoma è stato inserito uno o più frammenti di DNA esogeno
Transgene:frammento di DNA esogeno integrato
stabilmente nel patrimonio genetico di cellule animali o vegetali
Metodi di Ingegneria animale
Gene Targeting
Clonazione
Sono 3 i metodi principali di ingegneria animale
Transgenesi standard1
2
3
Transgenesi standard1
Microiniezione di DNA lineare nella cellula uovo fecondata • SCOPO: Guadagno di funzione• CARATTERISTICA: inserzione random, casuale
Introduzione di una sequenza di DNA purificata in uno dei due
pronuclei della cellula uovo fecondata
La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4
fasi distinte
1. Preparazione degli oociti fecondati
2. Preparazione dei costrutti
3. Preparazione delle femmine
“pseudogravide”
4. Screening della progenie
La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4
fasi distinte
Cocktail ormonale per la superovulazione:• PMS (pregnant mares serum)• HCG (human chorionic gonadotropin)
♀♀
♂
Accoppiamento
♀
Raccolta degli oociti fecondati
1. Preparazione degli oociti fecondati
2. Preparazione dei costrutti
3. Preparazione delle femmine
“pseudogravide”
4. Screening della progenie
La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4
fasi distinte
Costruzione del transgene Amplificazione del transgene
Purificazione del transgene
1. Preparazione degli oociti fecondati
2. Preparazione dei costrutti
3. Preparazione delle femmine
“pseudogravide”
4. Screening della progenie
La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4
fasi distinte
Accoppiamento delle femmine con maschio vasectomizzato
Trasferimento delle uova fecondate microiniettate con il gene di interesse nell’utero di femmina pseudogravida
♀ pseudogravida
♂ vasectomizzato
♀100-200X
1. Preparazione degli oociti fecondati
2. Preparazione dei costrutti
3. Preparazione delle femmine
“pseudogravide”
4. Screening della progenie
La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4
fasi distinte
Estrazione DNA dalle code della progenie
Analisi tramite PCR Analisi tramite Southern-blot
M C 1 2 3 4 5C 1 2 3 4 5
1. Preparazione degli oociti fecondati
2. Preparazione dei costrutti
3. Preparazione delle femmine
“pseudogravide”
4. Screening della progenie
L’inserzione del transgene è casuale
• RICOMBINAZIONE NON OMOLOGA• Non si sa dove si è localizzato il transgene;• Non si può regolare il numero di copie introdotte nel
pronucleo, né quante si uniranno in concatameri per l’integrazione;
• Guadagno di funzione o perdita di funzione?
“Incrociamo le dita!!”
Gene Targeting2
Ricombinazione omologa in embrionic stem (ES) cells • SCOPO: Perdita o modifica di funzione• CARATTERISTICA: inserzione mirata
La RICOMBINAZIONE OMOLOGA è il meccanismo che permette il gene
targeting
AGGTGCCTGACT TTCAGCCGATCCA
Gene inattivoAGGTGCCTGACT TTCAGCCGATCCAX X
La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte
1. Preparazione delle ES cells pluripotenti
e trasfezione2. Selezione delle ES
3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova
blastocisti
4. Screening della progenie
Preparazione del transgene
La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte
Preparazione delle ES pluripotenti dalla blastocisti
Elettroporazione
Sequenze di ricombinazione
Omologa
Neor – resistenza alla Neomicina
Tk - thymidine kinase
Gene non attivo
1. Preparazione delle ES cells pluripotenti
e trasfezione2. Selezione delle ES
3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova
blastocisti
4. Screening della progenie
La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte
Sequenze di ricombinazione
Omologa
Neor – resistenza alla Neomicina
Tk - thymidine kinase
Gene non attivo
Trattamento con neomicina e ganciclovir
X
X
No integrazione
Integrazione sito-specifica (1/1000)
Integrazione random
1. Preparazione delle ES cells pluripotenti
e trasfezione2. Selezione delle ES
3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova
blastocisti
4. Screening della progenie
La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte
ES inserite in una blastocisti di topo nero
1. Preparazione delle ES cells pluripotenti
e trasfezione2. Selezione delle ES
3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova
blastocisti
4. Screening della progenie
La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte
Topo “chimera”
1. Preparazione delle ES cells pluripotenti
e trasfezione2. Selezione delle ES
3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova
blastocisti
4. Screening della progenie
L’inserzione del transgene è mirata
• RICOMBINAZIONE OMOLOGA• Si conosce la localizzazione genica dell’inserimento del
transgene;• Problemi: espressione tempo e spazio specifica?
“Obiettivo raggiunto!”
Trasferimento del nucleo di una cellula somatica in un oocita anucleato
• SCOPO: ottenimento di “gemelli” di un fenotipo di interesse
Clonazione3
I Cloni vengono ottenuti attraverso
Somatic Cell Nuclear Transfer
Il materiale genetico viene copiato in toto
• Nuclear Transfer• Le cellule somatiche da cui si preleva il nucleo possono essere
ingegnerizzate prima del reimpianto.
Altre tipologie di Ingegneria animale
Animali reporter
Altre tecniche, oltre a quelle classiche, sono state sviluppate in
ingegneria animale
Knockout condizionali1
2
Knockout condizionali1
Eliminare un gene in un tessuto, in un organo o in una fase particolare di sviluppo
• SCOPO: ottenere informazioni più precise sulla funzione del
gene; garantire il normale sviluppo del topo knockout.
Il sistema Cre-LoxP è uno dei sistemi più utilizzati
La CRE è una RICOMBINASI LOXP sono le sequenze riconosciute da CRE
Gene da excidere
Esempio: delezione di IGF-1 fegato-specifica:
topi LID (liver IGF1 specific deficient)
Esone 4
LoxP
CreX
Promotore dell’albumina
X
CRECRE
80% IGF-I plasmatico
Inserimento di un gene codificante una proteina facilmente identificabile e rilevabile
• SCOPO: la proteina reporter dà informazioni rapide e
dinamiche sugli eventi molecolari che si vogliono studiare
Animali reporter2
La luciferasi è uno dei geni reporter più utilizzati nei topi
Sequenze regolatorie
• Gene ESOGENO• Emivita breve• Facilmente detectabile
Esempio: il topo reporter ERE-Luc
LuciferasiTkERE X2MAR MAR
Transgene inserito nel topo ERE-Luc
Applicazioni pratiche dell’Ingegneria animale
Studio di funzione genica (ricerca di base)
1Modelli di patologia umana
Produzione di biofarmaci
Screening di farmaci
2
3
4Produzione di organi per xenotrapianti
5
Transgenesi standard
Gene targeting
Clonaggio KO condizionale
Animale reporter
Studio di funzione genica (ricerca di base)
1
Inserimento di gene (o boost dell’espressione di un gene) tramite transgenesi standard
Palmiter et al, Nature, 1982
Delezione di un gene tramite gene targeting
ESTROGEN RECEPTOR
KNOCKOUT MICE
Couse & Korach,
Endocrine Reviews, 1999
Modelli di patologia umana2
Inserimento di gene (o boost dell’espressione di un gene) tramite transgenesi standard:
• Oncogeni (c-neu, c-myc, H-ras): tumori
• Antigeni di istocompatibilità: autoimmunità
• β-globina umana: talassemia
• Recettore LDL: aterosclerosi
• APP umana: morbo di Alzheimer
Delezione di un gene tramite gene targeting:
• Apolipoproteina E: aterosclerosi
• Glucocerebrosidasi: malattia di Gaucher
• CFTR umana: fibrosi cistica
• […]
Esempio: modelli di overespressione di APP umana per
lo studio della malattia di Alzheimer
Lord A, Neurobiol Aging, 2006
Produzione di biofarmaci3
+ In
sulin
a
+ Em
oglo
bina
+ tP
A
+ G
HProduzione di proteine ricombinanti
biologicamente attive nella ghiandola mammaria di animali transgenici
• Abbondanza: 5–10g/L al giorno paragonato ad 1 g/L delle cellule.
• Costo
• Adattabilità alle richieste
• Funzionalità: le proteine sono folded in maniera naturale
• Raccolta: facile purificazione dal latte
Pro/contro del “biopharming”
• Tempistiche: lunghi tempi per messa a punto e valudazione di animali transgenici
• Attesa della lattazione
• Inserzione casuale: può causare problemi all’animale
Screening di farmaci4
REPORTERPromotore
attivato
• L’attività del promotore è osservata in tempo reale e nel contesto fisiologico dell’intero organismo
Che caratteristiche deve avere un animale reporter per permettere
lo screening di farmaci?
• Permettere di localizzare le aree dove il composto è attivo
• Permettere di valutare la risposta del farmaco dopo ripetute somministrazioni
• Permettere la misurazione della minima dose efficace
• Permettere di identificare siti di accumulo in caso di somministrazioni croniche
Il modello ERE-Luc per lo screening di farmaci – in acuto
Nelle aree del corpo dell’animale Nelle aree del cervello dell’animale
Il modello ERE-Luc per lo screening di farmaci – in cronico
Produzione di organi per xenotrapianti
5
XRigetto dovuto alla reattività degli anticorpi umani verso le proteine
endoteliali esogene (che mancano di uno zucchero, il fucosio)
Inserimento in animali transgenici della fucosio-transferasi
Un maiale ci salverà??