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Gli indicatori biologici nello studio delle basse dosi dei cancerogeni
Antonio Mutti
Torino, 11 dicembre 2006: CONVEGNO NAZIONALEQuestioni aperte in tema di cancerogenesi ambientale: quali le possibili risposte.
Effetti delle basse dosi Cosa significa “BASSA DOSE”?
Mitridatismo (adattamento), Curve dose/risposta ad U (ormesi)
Importanza della via di assorbimento per gli elementi essenziali
Gli effetti di dosi elevate possono non avere alcuna relazione con ciò che si verifica a livelli parafisiologici Dosi diverse possono causare risposte differenti Curve dose/risposta non monotone possono riflettere
meccanismi multipli
“Think Lead“Think Lead“
Sampling
CrU
,g
/g c
reat
inin
e
1st 2nd 3rd 4th 5th 6th 7th 8th 9th0
5
10
15
20
25
30Geometric Mean + GSD
Biological Monitoring Based on Urinary Chromium in Chromeplating Plants
Malattia
Effettiirreversibili
Effetti critici
Effetti subcritici
Adattamento (?)VR
LEO
Dose, U.A.
Effetti
L’U.R. per il benzene è estrapolata su sei ordini di grandezza da 7 casi di leucemia osservati (coorte Plioform)
01
234
56
78
0.00
006
0.00
060.
006
0.06 0.
6 6 60 600
6000
?
Esposizione cumulativa a benzene, mg/m3 x anni
N.
Cas
i o
sser
vati Unità di
rischio
Stime dell’unità di rischio per il benzene (prima di 7 tabelle, con 8 stime su 21)
Unit risk estimate (ppm) Data set 95% lower
bound MLE 95% upper
bound 1. Rinsky (follow-up from 1950) 1.65•10-3 5.10•10-3 1.08•10-3 2. Rinsky (follow-up from 1940) 1.53•10-3 5.10•10-3 1.13•10-3 3. Rinsky (revised exposures) 1.78•10-3 6.43•10-3 1.44•10-3 4. Rinsky and Ott 7.78•10-4 2.89•10-3 6.87•10-2 5. Same as 4. (2 questionable cases added) 4.45•10-4 2.04•10-3 5.10•10-3 6. Wong SMR=50 assumed for unexposed 8.76•10-5 1.04•10-2 2.42•10-2 7. Rinsky, Ott and Wong 2.67•10-3 7.32•10-3 1.60•10-2 8. Same as 7. (SMR=100 assumed for unexposed) 1.56•10-3 3.55•10-3 6.43•10-3
Fonte: EPA (US)
Concentrations of airborne benzene associated with an excess lifetime risk of 1/10.000, 1/100.000 and 1/1.000.000 are, respectively, 17, 1.7 and 0.17 µg/m3
È il rapporto LOAEL/esposizione umana (LOAEL ricavato da studi nell’animale);
Si basa sull’interpolazione di dati sperimentali;Non richiede estrapolazioni tra specie né tra dosi; Non richiede scelta tra modelli;Evita l’uso di fattori di incertezza.
L’approccio ora prevalente (FDA, EFSA, EPA, etc.) è il “Margin of Exposure”
(MOE)
Interpretazione del MOE Non è una “linea netta”, intesa come indice
generale di rischio;
Valori elevati (> 1000) indicano una scarsa probabilità di effetti nocivi nell’uomo;
Valori vicino a 1 espongono a livelli a cui sono stati osservati effetti nocivi nell’animale;
Per valori tra 10 e 100, la gestione del rischio dipende da vari fattori (natura dell’effetto, numero e suscettibilità della popolazione esposta, possibilità di alternative, etc.).
Analisi Rischi/BeneficiAnalisi caso per caso:
Possibilità di esposizione a livelli associati con effetti tossici nell’animale;
Benefici associati con l’uso del prodotto che causa l’esposizione
Potenziali alternative e loro rapporto rischi/benefici
Esempio del MeHg e dell’apporto di
acidi grassi poli-insaturi 3 nel pesce
Rischio Cumulativo Esposizioni Multiple
Effetti combinati di miscele di compostiMeccanismi d’azione simili o diversi
Esposizioni concomitanti o sequenzialiL’ordine e la durata possono influenzare
eventuali interazioni Vie Multiple
Effetti diversi secondo la via di assorbimento (es. Mn per via gastroenterica o respiratoria)
Effetti combinati
EC(d1+d2)=Ed1 + Ed2 + Ed1• Ed2
Per Ed1• Ed2 > 0 sinergismo Per Ed1• Ed2 < 0 antagonismo (competitivo)
Per Ed1o Ed2 = 0 nessuna interazione Se entrambe le dosi sono subliminali, lo
svolgimento più frequente della formula è: EC(d1+d2)=0 + 0 + 0
Quali indicatori biologici usare alle basse dosi?
Indicatori validi (misure non valide sono comunque da evitare);
Indicatori facilmente interpretabili; Indicatori con il miglior rapporto
costi/qualità (proporzionati al quesito).
indicatore più sensibile (100 g/m3)
Interferenza acido sorbico
> 10.000 g/m3
aspecifico
Analisi difficile: instabile e aspecifico
Instabile e aspecifico, forte
influenza del polimorfismo
NQO1
Proposto (urine), ma controverso
Indicatori biologici di esposizione a BENZENE
LC-MS/MS
GC, HPLC,LC-MS/MS
Spettrofotometro colorimetro
HPLC, rivelatoreHPLC, rivelatore elettrochimico
GC-MS, SPME
Metodi (e costi delle attrezzature)
400.000 euro
4.000 euro
40.000 euro
80.000 euro
•No correlation between benzene exposure and urinary biomarkers. •All benzene biomarkers but EOS t,t-MA were correlated with U-cotinine.•GSTM1 polymorphism modulated S-PMA excretion
Environmental and biological monitoring of benzene exposure in a cohort of Italian taxi drivers
(Manini et al., 2006)
1000 2000 3000EOS U-Cotinine (g/l)
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Log
EO
S S
-PM
A (g
/l)
Log EOS S-PMA = 0.51 + 0.00 x EOS U-Cot
r = 0.673
0 0 1000 2000
EOS U-Cotinine (g/g creatinine)
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
Log
EO
S U
-B (g
/l)
r = 0.631
Log EOS U-B = -0.11 + 0.00 x EOS U-Cot
MA + PGA (mg/l)
40010010
M1
-R (g
/l)
5000
1000
500
100
50
10
GSTM1 PositiveR2 = 0.37 NullR2 = 0.33
- Conclusione 1:Due differenti BEI per i PHEMA (Haufroid et al.,
2001) 1330 g/g creat per i soggetti GSTM1null 2878 g/g creat per i soggetti GSTM1pos
- Conclusione 2:L’interferenza del genotipo GSTM1 limita l’uso
dei PHEMA come indicatori di esposizione a stirene (De Palma et al., 2001).
Il genotipo GSTM1 modifica la regressione tra i principali metaboliti dello stirene il principale PHEMA nelle urine di lavoratori esposti
Reference values for styrene metabolites in urine
0 0.43 0.86 1.29 1.71 2.14 2.57 3.00
Mandelic acid, mg/g creat.
0
3
6
9
12
No. of
subje
cts
0 0.20 0.40 0.60 0.80
Phenylglyoxylic acid, mg/g creat.
2
4
6
8
No. of
subje
cts
0.084-2.339 mg/g creat. 0.009-1.238 mg/g creat.
Potential sources: Smoking habits, air pollution (ethylbenzene), food packaging (?)Manini et al., Int. Arch. Occup. Environ. Health, 2004
Antonio MuttiUniversity of Parma
Interazioni Geni-Ambiente nei tumori
Solo Geni
Solo Ambiente
Genix
Ambiente
Contributo relativo dell’ambiente
N.
di ca
si
5 95
Epidemiologia molecolare e le interazioni Gene-Ambiente a basse dosi
Polimorfismi metabolici
Esposizione AttivazioneDetossificazione ad agenti chimici Alta
Bassa
Alta
Bassa
Bassa
AltaAlta
Bassa
RR
Altri fattori:
•Polimorfismo degli enzimi di riparazione del DNA
•Fenotipo (induzione, inibizione competitiva legata ad abitudini voluttuarie, stili di vita, co-esposizioni ecc.)
•Sistema immunitario
•Polimorfismo dei recettori di ormoni, fattori di crescita, neurotrasmettitori, ecc.
•….
Antonio MuttiUniversity of Parma
Bassa
Alta
Bassa
Alta
Bassa
Alta
Genomica e proteomica sono promettenti per la diagnosi, ma non sembrano altrettanto utili per la prevenzione.
Le interazioni (gene-gene e gene-ambiente) sono complesse e instabili (l’espressione genica è spesso transitoria).
La corrispondenza tra genotipo e fenotipo può essere scarsa, il che può condurre a false conclusioni.
Valutazione (provvisoria) dell’epidemiologia
molecolare
Antonio MuttiUniversity of Parma
Uca Pugnax
(Granchio violinista)
Stiamo puntando troppo sulla “genomica” per afferrare le interazioni gene-ambiente?
GENI
ambiente
Antonio MuttiUniversity of Parma
Unlike the genome, the exposome… evolves throughout the lifetime of the individual... However, the challenge may not be more daunting than the one faced two decades ago of investigating an estimated 10 million SNIPs in the human genome.
Chris Wild, 2005
On the need for an “exposome”
Antonio MuttiUniversity of Parma
Example of metallic elementsmeasured by ICP-MS in exhaled breath
Antonio MuttiUniversity of Parma
A. Mutti et al. Chest, 2006
Università degli Studi di Parma (Antonio Mutti, P.I.) Università degli Studi di Brescia, Italia (Pietro Apostoli) University of Massachusetts at Lowell, USA (Donald Milton) Université Catholique de Louvain, Belgio (Alfred Bernard)
Metals in exhaled breath condensate as COPD biomarkers
Grant: R01 HL72323
Transition elements(Cr, Cu, Mn)
Heavy metals(Cd, Pb, Hg)
Strongoxidants
Oxidativestress
High affinityfor SH groups
GSH depletion
Disease (COPD)
HypoxiaRe-oxygenationinjury
Cell injury
Tissue injuryand remodelling
Inflammation
Perfusion/ventilationimbalance
Elements in tobacco smoke
A. Mutti. Grant NIH R01 HL72323
Antonio Mutti, Massimo Corradi, Matteo Goldoni, Maria Vittoria Vettori, Alfred Bernard and Pietro ApostoliExhaled Metallic Elements and Serum Pneumoproteins in AsymptomaticSmokers and Patients With COPD or Asthma
(CHEST 2006; 129:1288–1297)
Antonio Mutti, Massimo Corradi, Matteo Goldoni, Maria Vittoria Vettori, Alfred Bernard and Pietro ApostoliExhaled Metallic Elements and Serum Pneumoproteins in AsymptomaticSmokers and Patients With COPD or Asthma
(CHEST 2006; 129:1288–1297)
0.00
0.05
0.10
0.15
0.201.00
1.25
1.50
1.75
Controls
*
*
*
Ex smokersSmokers
COPD patients
Cd
(
g/L
) in
EB
C
0.000
0.025
0.050
0.52
0.92
Controls Smokers Asthmatics COPD
*
**
*
1.25
1.50
1.75
Cd
in E
BC
(
g/L
)Antonio Mutti, Massimo Corradi, Matteo Goldoni, Maria Vittoria Vettori, Alfred Bernard and Pietro ApostoliExhaled Metallic Elements and Serum Pneumoproteins in AsymptomaticSmokers and Patients With COPD or Asthma
(CHEST 2006; 129:1288–1297)
NSCLC 2
NSCLC 4Control 1Control 2Control 3
VOCs in Alveolar Air from Patients with Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) and controls.
GC-MS profiles
Retention time Retention time
Rel
ativ
e in
ten
sity
(S
/IS
rat
io)
Antonio MuttiUniversity of Parma
Conclusioni
Le tecniche moderne consentono di misurare l’esposizione della popolazione generale.
Il fattore limitante è il costo, che - per unità di rischio - è in crescita esponenziale.
Nello studio delle interazioni gene-ambiente dovrebbero essere dedicate più energie alla definizione di “esposomi” ed al monitoraggio biologico.
Non solo, ma soprattutto a basse dosi, è cruciale la scelta dei controlli e la verifica della loro appartenenza alla popolazione generale.
Antonio MuttiUniversity of Parma
Importanza (e difficile scelta) dei controlli nello studio degli effetti di basse dosi: il ruolo dei valori di riferimento
Popolazione generale
Gruppo non esposto
Vicini con esposizione simile
Popolazione generale
Soggetti suscettibili
V.R.
V.R.
Recent developments in human biomonitoring: non-invasive assessment of target tissue dose and effects of pneumotoxic metals
Antonio Mutti
Cromo(VI) nel condensato dell’aria esalataEstratto da:
Exhaled biomarkers Exposure Effect(Target tissue dose) (NO, H2O2, mediators, etc.)
Kidney
Liver
Lung
G.I.Tract
SkinBlood
Urine
Systemic Markers of Internal Exposure/Dose
Target site
Adverse effects by air pollutants may be due to their strong reactivity or poor solubility.In either cases, retained dose (exposure) seems to be the main determinant of pneumotoxicity.
TURBO-DECCS: Transportable Unit for Research on Biomarkers Obtained with Disposable Exhaled Condensate Collection Systems
Exhaled Breath Condensate:How to collect it?
Transportable (3Kg), temperature control, disposable device
non invasive method; simple (disposable
device), suitable for
field studies; easy to repeat; applicable in all
subjects; simple matrix (water); analysis possible
without sample
manipulation.. Control over Control over
temperaturetemperature
EBC Collection in Practice
Owing to higher temperature, longer electrolitic process, and higher Cr(VI) concentrations, hard (thick) chromeplating is associated with higher exposure levels as compared to decorative (thin) plating.
Cr(VI)-exposed workers
From Guidetti, Thesis, University of Parma, 2004
Chrome plating
Chrome platingCr(VI)-exposed workers
Caglieri et al. EHP 2006
Pre-shift Fri. Post-shift Fri. Pre-shift Mon.
0.1
1
10
100
6.637.84
4.73
p<0.0001
p=0.025
Reference Interval
Cr-
U (
g/g
creat)
Caglieriet al.EHP 2006
ChromeplatingChromeplatingCr(VI)-exposedworkers
Pre-shift Fri. Post-shift Fri. Pre-shift Mon.
0.01
0.1
1
10
100
3.78 4.98
2.80
p=0.0272
p=0.0044
Reference Interval
Cr-
EB
C (
g/l)
Reference Interval
Caglieri et al. EHP 2006
Chrome platingCr(VI)-exposed workers
Pre-shift Fri. Post-Shift Fri. Pre-shift Mon.
0.01
0.1
1
10
0.370.61
0.18
p=0.007
p=0.0092
p<0.0001
Reference interval
H2O
2-EB
C (
M)
Reference Interval
0.01 0.1 1 10 100
0.01
0.1
1
10
r=0.56;p<0.0001
Cr-EBC(g/l)
H2O
2-EB
C (
M)
Caglieri et al. EHP 2006
Chrome platingEBC from Cr(VI)-exposed workers
Cr speciation in EBC
Next morningPost-shift
Goldoni et al. Anal Chim Acta 2006
Chrome plating
0.1
1
10
Cr(VI)Cr totCr(VI)
Cr-
EB
C (
g
/ l )
Cr tot
2.6 1.50.9 0.2*
*
Goldoni et al. Anal Chim Acta 2006
Cr speciation in EBC
Chrome plating
0.01
0.1
1 **
Cr(
VI)
/Cr T
OT
67.7% 33.5% 16.5%
***
* = p<0.05; ** = p<0.01
End-of-shift Next morningAirborne
Airborne Cr(VI) was reduced by 50% in airway lining fluid sampled at the end of exposure.
A further 50% reduction was observed after 15 h.
The persistence of Cr(VI) in EBC and its correlation with inflammation markers (H2O2) supports the use of EBC to assess target tissue levels of Cr(VI).
Conclusions
Cr in EBC Chrome plating
Acknowledgements University of Parma, Italy: Massimo
Corradi, Matteo Goldoni, Paola Manini, Olga Acampa, Rossella Alinovi, Roberta Andreoli, Andrea Caglieri, Giuseppe De Palma, Giuseppina Folesani, Paola Mozzoni, Diana Poli
University of Brescia, Italy: Pietro Apostoli UCL, Brussels, Belgium: Alfred Bernard University of Massachusetts at Lowell, MA: Donald Milton NIOSH, Morgantown, WV: Kay Kreiss, Nancy Sahakian ITALCHILL, Parma, Italy: Carlo Valesi