Post on 15-Feb-2019
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REQUISITI PER LA VALIDAZIONE DI UN
TEST DI LABORATORIO
�Efficacia tecnica: è in relazione alla metodica utilizzata
�Accuratezza diagnostica: è correlata a decisioni diagnostiche e terapeutiche
METODI IMMUNOLOGICI PER IL
RILIEVO DI AUTOANTICORPI
Metodi immunochimici :
consentono la ricerca qualitativa (presenza/assenza) degli autoanticorpi nel siero dei pazienti
1. Immunoblotting : Western Blot (WB), Dot Blot (DB)
2. Immunofluorescenza indiretta (IFI)
Metodi immunometrici :
consentono la misurazione quantitativa delle concentrazioni autoanticorpali
1. Immunoenzimatico (EIA, ELISA)
2. Immunofluorimetria e sue varianti (FEIA)
3. Immunochemiluminescenza (CLIA)
4. Radioimmunologico (RIA)
IMMUNOFLUORESCENZACARATTERISTICHE GENERALI
� Utilizza anticorpi anti-imunoglobuline umane
coniugate con una sostanza fluorescente
�per rivelare la presenza di autoAb fissati ad
�autoantigeni specifici espressi in
� substrati differenti costituiti da cellule in coltura
e\o sezioni di tessuti fissati su supporto vetroso.
� Cellule HEP-2 da carcinoma laringeo umano
� Emoflagellato: Crithidia luciliae
� Granulociti neutrofili umani
� Triplo tessuto (fegato-rene-stomaco)di
ratto o di topo
� Pancreas umano o animale
� Esofago di scimmia
� …
IFI: ES. DI SUBSTRATO UTILIZZATO
ANAANA
DNADNA
ANCAANCA
APCA,ASMA,APCA,ASMA,
LKM, AMALKM, AMA
ICAICA
EMAEMA
....
IFI:TECNICA DI ESECUZIONE
� Diluizione siero ( 1:40, 1:20, 1:5 ecc.)
� Incubazione con il substrato
� 1° Lavaggio
� Incubazione con Ac anti-Ig umane coniugate con
fluorocromo;
� 2° Lavaggio
� Montaggio dei vetrini in glicerolo al 10% in PBS;
� Lettura dei preparati con microscopio a
fluorescenza
IFI: PREPARATORI AUTOMATICI
Sistemi automatici per la preparazione dei vetrini in
grado di eseguire in automazione le fasi di:
�Diluizione
�Dispensazione
�Incubazione
�Lavaggio
Pro: “completa” automazione
Contro: attenzione alla qualità della preparazione
�NEW ENTRY: SISTEMI PER L’ACQUISIZIONE , L’ANALISI E
L’ARCHIVIAZIONE DELLE IMMAGINI
IFIIFIVANTAGGIVANTAGGI LIMITI
• Buona sensibilità (95%)
• Semplice,rapido e
riproducibile
• Numero elevato di
reattività antigeniche
distinte
• Ottimizza l’iter
diagnostico (percorso
ragionato e a cascata)
• Costo contenuto
• Tecnica soggettiva
• Richiede di ottimizzare la
standardizzazione
• Perdita di alcuni Ag
nucleari altamente solubili
nei lavaggi
• Metodo qualitativo
• Deve essere completato
da indagini sierologiche
antigene specifiche
IFI:CONTROLLO DI QUALITA’ INTRALAB
IFI:CONTROLLO DI QUALITA’ INTRALAB
In ogni seduta analitica deve essere inserito un Controllo positivo
e un Controllo negativo
CONTROLLO POSITIVO
serve a confermare la correttezza delle procedure di
esecuzione dell’esame ( dispensazione sieri, lavaggi
vetrini, efficienza del coniugato)
CONTROLLO NEGATIVO
indispensabile per una valutazione del grado di auto-
fluorescenza del substrato
Lettura e interpretazione IFI
1.Definizione POSITIVO/NEGATIVO
2.Definizione del TITOLO Valutazione quantitativa discreta effettuando diluizioni seriate fino a scomparsa della
fluorescenza
3. Definizione del PATTERN
4.Confronto tra due operatori
Lettura e interpretazione degli ANA
Definizione del Pattern
(26 classificati)
IMMUNOBLOTTING: tecnica
�Separazione elettroforetica degli Ag (su un gel di
poliacrilamide)
�Western Blotting: la separazione elettroforetica viene
trasferita su una membrana di nitrocellulosa
�Dot Blot: al termine dell’elettroforesi le proteine sono
“selezionate” e quindi trasferite su nitrocellulosa
� Incubazione con siero diluito
� incubate con un antisiero coniugato con un enzima
�substrato
�Reazione di evidenziazione, confrontate con marcatori di PM
noto per WB
Dot e Line BlotTrasferimento diretto di molecole su membrana di nitrocellulosa o nylon.Si ottengono aspetti:
•punto dot blot
•linea line blot
IMMUNOBLOTTING: vantaggi
• Alta flessibilità
• Praticità
• Riproducibilità
• Alta sensibilità e specificità
• Possibilità di automazione
completa
CARATTERISTICHE DEI METODI IN IMMUNOBLOTTING
�Dot blot e Line blot:
• informazioni limitate agli antigeni
selezionati ,
• facile interpretazione
�WB:
• pattern antigenico completo per PM
• presenta soggettività e
• difficoltà nella interpretazione del
risultato
METODI IMMUNOMETRICI
CONSIDERAZIONI GENERALI METODI IMMUNOMETRICI
� Immunoenzimatica,
� immunochemiluminescenza e
� immunofluoro-enzimatica
rispondono all’esigenza di automazione
delle procedure analitiche e permettono
• riduzione dei costi
• esecuzione su larga scala
• aumento dell’affidabilità analitica
�antigeni specifici adesi ad una
fase solida in polistirene
�un reattivo rivelatore costituito
da anticorpi anti-
immunoglobuline umane
coniugati con un enzima
� e di un substrato dell’enzima
IMMUNOENZIMATICA in fase solida
METODICA IMMUNOENZIMATICA ( ELISA )
Vantaggi
�Analisi di numerosi campioni
�Buona automazione
�Tecnica quantitativa
Problematiche
�natura , qualità e quantità dell’Ag
�efficacia del suo adsorbimento alla fase solida
�stabilità Ag
� organizzazione: a test/non a paziente
Sistemi monostrip a determinazione singola basati sui test ELISA
Utilizzati per:
� test rari , es:anti-insulina, anti-fattore intrinseco
� test a carattere di urgenza es. : anti-tTGIgA in sospetto crisi celiaca
DiluizionecampionePozzetti di
reazione
Reattivi
•Alegria® Test Strip sono sistemi basati sui test ELISA
•Taratura Memorizzata
• prevede un set completo di reagenti.
Campione negativo
Campione positivo
UN METODO INNOVATIVO
PER AUTOIMMUNITA’Tecnologia CLIA: Chemiluminescence enzymeimmunoassay:
� test quantitativo in due step
�fase solida con Ag immobilizzato
� 1° incubazione Ac specifici
� 2° incubazione coniugato con DMAE
� aggiunta di soluzione innescante
� rilevazione
Principio del test: Lavaggio Lavaggio
Fase solida: particelle magnet. rivestite con autoAg
Autoanticorpispecifici
Coniugato:
Ac Mo marcato DMAE
Attivazione
Rilevazione tramite CL
+ +
UN METODO INNOVATIVO PER
AUTOIMMUNITA’: Tecnologia CLIA� strumento completamente automatizzato ad accesso random
� concepito per test di autoimmmunità
� fino a 15 immunodosaggi simultaneamente
� 21 test attualmente disponibili
�costante aggiornamento dei marcatori Ac
� test quantitativi validati clinicamente
� possibilità di test reflex
• malattie autoimmuni sistemiche
• celiachia
• sindrome anti-fosfolipidi
• Vasculiti ANCA associate
dia
gn
ostica
dia
gn
ostica
CRITERI PER LA SCELTA di UN METODO
è importante giungere alla scelta di un metodo in base a:
� Finalità del test:
� Rapporto con i clinici
� Compatibilità del
metodo con
• Screening
• Approfondimento
• Monitoraggio• Quantitativo? Qualitativo?
• Indagini mirate
• specifiche esigenze
diagnostiche
• Struttura Lab
• Modello organizzativo
METODOLOGIE E TEST PRESENTI METODOLOGIE E TEST PRESENTI
ATTUALMENTE PRESSO IL ATTUALMENTE PRESSO IL
LABORATORIO DI IMMUNOPATOLOGIA E LABORATORIO DI IMMUNOPATOLOGIA E
ALLERGOLOGIA DELLA AZIENDA ALLERGOLOGIA DELLA AZIENDA
OSPEDALIEROOSPEDALIERO--UNIVERSITARIA DI UDINEUNIVERSITARIA DI UDINEAlcuni test vengono eseguiti con più metodiche es:
Anti-centromero: IFI-ELISA-blot
Anti-DNA: ELISA-IFI
MODELLO ORGANIZZATIVO LAB UDINE
Utilizza metodi :
� validati
� svariate tecnologie
� sia di tipo quantitativo che qualitativo
� automatizzati, semi autom. e manuali (dotblot)
Si pone come obiettivo :
� attuare percorsi diagnostici dedicati
� lavorare con appropriatezza
� effettuare approfondimenti necessari
Come si inserisce il lavoro del tecnico di
laboratorio biomedico?
Il TSLB deve:
� conoscere test e metodi
� averne padronanza e dimestichezza
� conoscere i percorsi diagnostici messi in atto
� potere aggiungere test necessari appropriati
� essere in grado di utilizzare più metodiche in
una giornata per
� seguire e portare a termine iter diagnostici
anche complessi
Alcuni esempi di percorsi diagnostici:
MALATTIA AUTOIMMUNE SISTEMICA
Test 1°livello Test 2°livello Test 3°livello Test 4°livello
ANA IFI ENA EIA ENA BLOT ENA BLOTSclero/Miosite
DNA EIA DNA IFI DNA BLOT NucleosomiBLOT/EIA
ENA EIA Screening
ENA Sp. EIA ENA BLOT
ANCA IFI ANCA EIA MPO/PR3
ANCA BLOT
Pattern rari : membrana nucleare
Pattern sovrapposti: SPECKLED e CENTROMERICO
Centromeroa basso titolo?
TEST DI 2° LIVELLO PER CONFERMA SPECIFICITA’’
Centromeroa basso titolo?
Test anti-dsDNA Crithidia
MALATTIE AUTOIMMUNI SISTEMICHE
RICERCA Ac. SPECIFICI es: anti-dsDNA
Anti-dsDNA
Test 2° livello:IFI
test più specifico
Anti-dsDNA
Test 1° livello. ELISA
POS
Alcuni esempi di percorsi diagnostici:
MALATTIA AUTOIMMUNE D’ORGANO
Test 1°livello Test 2°livello Test 3°livello Test 4°livello
ANTI-Mitocondri IFI
LIVER BLOT
Anti-tTG IgAEIA
EMA IgAIFI
Anti-tTG IgAEIA
IgA totaliturbidimetria
Anti-tTG IgGEIA
Anti-DGPIgG
APCAIFI
APCAEIA
RICERCA AC ANTI-MITOCONDRI IFI SU TESSUTO DI RATTO
Positività anti-mitocondriale visibile come punteggiatura su cell.tubuli renali ed epatociti
RENE
FEGATO
RENE FEGATO
Anti-mitocondrio
M2
Line Blot con Antigeni specifici per epatopatia di tipo autoimmune
LINE-BLOT: TEST DI 2° LIVELLO PER CONFERMA SPECIFICITA’ AMA
Line Blot con Antigeni specifici per
epatopatia di tipo autoimmune
Anti-SLA : Si associa ad epatite autoimmune
LINE-BLOT:TEST DI 1° LIVELLO PER ALTRI Ac. come a-SLA o a-LC1
DIAGNOSI DI GASTRITE ATROFICA AUTOIMMUNE
Fluorescenza cellule parietali stomacoAutoanticorpi specifici:ATPase H+/K+ pompa protonica
IFI : mucosa gastrica ratto
In caso di positività a basso titolo dubbia o sovrapposizione altri autoAc (es.AMA)
N
P
ELISA: Ag specifico
DIAGNOSI DI MAL. CELIACA
Anti-endomisioIgA in IFI : terzo infer. Esofago scimmia pattern tipico 20X.
Ricerca anti-tTG IgA
Test di 1° livello ELISA
EMA IgA:
Test 2° livello IFI
test più specifico
POS
Paziente: F.C. anni 16 femminaPresentazione clinica: celiachia atipicaanti-tTG IgA = 39 UA (cut off 10 UA)Anti- peptidi deamidati gliadina IgA e IgG = positivi
Diluizione 1:5 (40x)
Diluizione 1:20 (20x)Diluizione 1:5 (40x)
Diluizione 1:100 (20x) Diluizione 1:200 (20x)
• La MC: prevalenza 1:100
• Nei soggetti con deficit assoluto di IgA (uno ogni 700 circa) la MC ha una prevalenza 5-10 volte superiore
• I pazienti con deficit assoluto di IgA e MC non producono a-tTG IgA ma a-tTG IgG
• Il test di 1°livello per MC è a-tTG IgA
• Tutte le richieste per a-tTG IgA dovrebbero comprendere anche il dosaggio delle IgA totali (in realtà solo il 20% soddisfa tale requisito)
Ricadute dei percorsi clinico-diagnostici sul modello organizzativo:
il caso della malattia celiaca
Ricadute dei percorsi clinico-diagnostici sul modello organizzativo:
il caso della malattia celiaca• Esecuzione del test a-tTG EIA con inserimento di
un siero noto con deficit assoluto di IgA
• I sieri con valori di assorbanza molto bassi (comparabile a quello del siero con deficit) eseguono il test per IgA totali
• Se confermato il deficit esecuzione dei test EIA a-tTG IgG e anti-DGP IgG
• Il referto viene accompagnato da un commento che spiega l’iter seguito e indica il significato dell’eventuale deficit di IgA e della eventuale diagnosi di MC.
CONCLUSIONI• Complessità tecnologica e diagnostica• Organizzazione e gestione dei campioni
biologici impegnativa, richiede attenzione
• Necessità di middelware dedicati al settore autoimmunità
• Si richiede: conoscenza dei percorsi d. e delle indicazioni cliniche generali anche da parte del TSLB e
• stretta interazione tra dirigenti e personale tecnico