DNA ReplicationDNA Replication

DNA Replication IIDNA Replication II

Replicazione e ricombinazione del DNAReplicazione e ricombinazione del DNA

La replicazione semiconservativaLa replicazione semiconservativaTre modelli proposti per la replicazione del DNA

La replicazione è semiconservativa: ogni frammento di DNA serve da stampo per la sintesi di una nuova molecola di DNA

Esperimento di Meselson Esperimento di Meselson e Stahle Stahl

- centrifugazione in gradiente di densità all’equilibrio per distinguere DNA contenenete 14N pesante e DNA 15N più leggero

DEFINIZIONI e TERMINOLOGIA:DEFINIZIONI e TERMINOLOGIA:

Replicone= unità di replicazione con propria origine di replicazione. Origine di replicazione=zona specifica del cromosoma dove le doppia elica si denatura in singoli filamenti, esponendo le basi per la sintesi di nuove eliche.Bolla di replicazione:regione del cromosoma dove il DNA è a singole elica e dal quale la replicazione procede in modo bidirezionale.

Le modalità di replicazioneLe modalità di replicazione1. La replicazione teta1. La replicazione teta

Comune in E.Coli e in altri organismi con DNA circolare

2. La replicazione a circolo rotante2. La replicazione a circolo rotante

Comune in alcuni virus e nel fattore F di E.coli

3. La replicazione lineare negli 3. La replicazione lineare negli eucariotieucarioti

Requisiti per la replicazione:-stampo di DNA a singolo filamento-substrati da assemblare nel filamento di neoformazione-enzimi e altre proteine che “leggono” lo stampo e assemblano i substrati

La direzione della replicazioneLa direzione della replicazione

La sintesi del DNA è La sintesi del DNA è continua su un filamento continua su un filamento di DNA stampo e di DNA stampo e discontinua sull’altrodiscontinua sull’altro

Modello tetaModello teta

Modello circolo rotanteModello circolo rotante

Replicazione lineareReplicazione lineare

La replicazione del La replicazione del DNA battericoDNA batterico

- L’INIZIO- L’INIZIOIn E.coli la replicazione ha inizio quando le proteine iniziatrici si legano a oriC, l’origine di replicazione, provocando lo svolgimento di un breve tratto di DNA.

- LO SVOLGIMENTO- LO SVOLGIMENTOLa DNA elicasi svolge il DNA legandosi al filamento ritardato che funge da stampo a livello di ogni forcella di replicazione e muovendosi in direzione 5’ 3’ lungo il filamento.

-GLI INNESCHI e L’ALLUNGAMENTOGLI INNESCHI e L’ALLUNGAMENTOLa primasi sintetizza brevi tratti nucleotidici di RNA, fornendo un gruppo 3’-OH a cui la DNA polimerasi può aggiungere nucleotidi di DNA.

DNA Polymerase III DNA Polymerase III The "real" polymerase in E. coli

• At least 10 different subunits • "Core" enzyme has three subunits - , ,

and • Alpha subunit is polymerase • Epsilon subunit is 3'-exonuclease • Theta function is unknown • The beta subunit dimer forms a ring

around DNA • Enormous processivity - 5 million bases!

DNA Polymerase I DNA Polymerase I Replication occurs 5' to 3'

• Nucleotides are added at the 3'-end of the strand • Pol I catalyzes about 20 cycles of polymerization before

the new strand dissociates from template • 20 cycles constitutes moderate "processivity" • Pol I from E. coli is 928 aa (109 kD) monomer • In addition to 5'-3' polymerase, it also has 3'-5'

exonuclease and 5'-3' exonuclease activities

- La DNA LIGASI- La DNA LIGASILa DNA ligasi chiude l’interruzione lasciata dalla DNA polimerasi I nello scheletro di zucchero-fosfato dopo che quest’ultima ha aggiunto il nucleotide finale.

- LA FORCELLA DI - LA FORCELLA DI REPLICAZIONEREPLICAZIONE

Modello di replicazione del DNA in E.coli:

le due unità della DNA pol III sono connesse e il filamento ritardato che funge da stampo forma un anello tale che la replicazione possa avere luogo sui due filamenti di DNA antiparalleli.

-LA FEDELTA’ DELLA REPLICAZIONE DEL DNALA FEDELTA’ DELLA REPLICAZIONE DEL DNA-selezione dei nucleotidi-correzione di bozze-riparazione dei malappaiamenti

Other Proteins That Assist DNA Other Proteins That Assist DNA ReplicationReplication

• Helicase, topoisomerase, single-strand binding protein

Table 16.1

La replicazione del DNA negli eucariotiLa replicazione del DNA negli eucarioti

Microfotografia elettronica di DNA eucariotico durante il processo della replicazione: il DNA neosintetizzato è già coperto da nucleosomi

Polimerasi nei ProcariotiPolimerasi nei ProcariotiI Procarioti possiedono cinque tipi di DNA Polimerasi:

•DNA Polimerasi I: implicata nella riparazione del DNA e nella rimozione degli inneschi dei frammenti di Okazaki. Possiede attività esonucleasica sia in direzione 5'->3', sia in direzione 3'->5' •DNA Polimerasi II: indotta da danni al DNA per riparazione incline all'errore (error-prone). Ha attività polimerasica 5'->3' ed esonucleasica 3'->5' •DNA Polimerasi III: l'enzima principale per la replicazione, con attività polimerasica 5'->3' ed esonucleasica (nella correzione di bozze, o proofreading) 3'->5'. Attiva sia nella sintesi del filamento leading, sia in quella dei frammenti di Okazaki. •DNA Polimerasi IV-V: anch'esse coinvolte nella riparazione incline all'errore

Polimerasi negli EucariotiPolimerasi negli Eucarioti

Le Polimerasi degli Eucarioti sono costituite invece da:

•DNA Polimerasi α: è una primasi (enzima che sintetizza i primer di RNA) e procede inoltre all'allungamento dei primer con alcune centinaia di deossiribonucleotidi.

•DNA Polimerasi δ: l'enzima principale della replicazione eucariotica. Sintetizza sia il filamento leading, sia il filamento lagging. Riempie inoltre le interruzioni tra i frammenti di Okazaki.

•DNA Polimerasi β: coinvolta nella riparazione del DNA

•DNA Polimerasi γ: replica il DNA mitocondriale

•DNA Polimerasi ε: stessa funzione della Polimerasi δ.

Prokaryotes Eukaryotes

5 polymerases (I, II, III, IV,V) 5 polymerases--I--excision repair, removal of RNA primers 

--polymerization

II-repair repair

--mitochondrial

III-main enzyme main enzyme

IV,V-repair, special conditions --unknown

polymerases also exonucleases not all exonucleases

1 Origin of replication many origins

Okazaki fragments 1000-2000 nuc.Okazaki fragments 150-200 nuc.

no proteins on DNA histones

Tipo di organismo Nome scientifico Ripetizione telomerica (direzione 5' -> 3')

VertebratiHomo sapiens, Mus musculus, Xenopus laevis

TTAGGG

Funghi Neurospora crassa, Physarum, Didymium TTAGGG

Protisti Dictyostelium discoideum AG(1-8)

Kinetoplastea (protozoi) Trypanosoma, Crithidia TTAGGG

protozoi ciliati

Tetrahymena, Glaucoma TTGGGG

Paramecium TTGGG(T/G)

Oxytricha, Stylonychia, Euplotes TTTTGGGG

Apicomplexa Plasmodium TTAGGG(T/C)Piante superiori Arabidopsis thaliana TTTAGGGAlghe verdi Chlamydomonas TTTTAGGGInsetti Bombyx mori TTAGGAnellidi Ascaris lumbricoides TTAGGC

Lieviti a scissione binaria Schizosaccharomyces pombe TTAC(A)(C)G(1-8)

Lieviti gemmanti

Saccharomyces cerevisiaeTGTGGGTGTGGTG (da stampo RNA)o G(2-3)(TG)(1-6)T (sequenza consenso)

Candida glabrata GGGGTCTGGGTGCTG

Candida albicans GGTGTACGGATGTCTAACTTCTT

Candida tropicalisGGTGTA[C/A]GGATGTCACGATCATT

Candida maltosa GGTGTACGGATGCAGACTCGCTT

Candida guillermondii GGTGTAC

Candida pseudotropicalisGGTGTACGGATTTGATTAGTTATGT

Kluyveromyces lactisGGTGTACGGATTTGATTAGGTATGT

Modello di Holliday:rottura singolo filamentoModello di Holliday:rottura singolo filamento

Rot t

ura

dop

pio

fila

men

t oR

ot t

ura

dop

pio

fila

men

t o