DNA

1

RNA

Uracile al posto

della

Timina

Sempre a SINGOLO FILAMENTO

RNA MESSAGGERO

Filamento lineare di sequenze

nucleotidiche: copia l’informazione

presente sul DNA e porta il messaggio a

livello dei ribosomi

RNA RIBOSOMALE

componente dei ribosomi: fornisce un

meccanismo per decodificare l’mRNA in

amminoacidi

70S

3

Subunità 30S contiene

l’rRNA 16S

Subunità 50S contiene

l’rRNA 23S + 5S

RNA TRANSFER

lega e trasferisce un amminoacido specifico

ad una catena polipeptidica in crescita a

livello dei ribosomi

4

La replicazione

5

INTERVENGONO PER LA

FORMAZIONE DELLA

FORCELLA =

DENATURAZIONE

SINTETIZZANO I PRIMERS

Il codice genetico

64 possibili triplette (codoni)

Codone AA Codone AAUUU Fenilalanina ACU TreoninaUUC Fenilalanina ACC TreoninaUCU Serina ACG TreoninaUCC Serina ACA TreoninaUCG Serina GGU GlicinaUCA Serina GGC GlicinaCCU Prolina GGG GlicinaCCU Prolina GGG GlicinaCCC Prolina GGA GlicinaCCG Prolina CAU IstidinaCCA Prolina CAC Istidina

Alcuni AA sono specificati da più di un codone

DEGENERAZIONE DEL CODICE GENETICO per minimizzare gli effetti delle mutazioni

6

61 codoni = di senso, specificano per i 20

amminoacidi

3 codoni= di stop, sono impiegati come

segnale di arresto della traduzione: TAA,

TAG, TGA

codone di inizio: ATG (GTG TTG), a cui

corrisponde un tRNA che trasporta una N-

formil-metionina

7

gene

Sequenza nucleotidica continua,

specificata da un codone di inizio,

un certo numero di codoni interni

a cui si aggiunge il codone di stop

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Codifica per un prodotto del

fenotipo

ORF= OPEN READING FRAME

REGIONE CODIFICANTE,

MA FENOTIPO

SCONOSCIUTO

La trascrizione

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Il sito promotore

Ribosomal Binding

Site = RBS

GAGG

AAGG

GGA

GGAG

AGGA

10

La traduzione

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INIZIO ATG GTG TTG CTG

STOP TAA TAG TGA

Promotore della trascrizione

GENE

OPERONE

Schema di lettura aperto: Open Reading Frame

ORF

gene proteina

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Operone ribosomale

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Regolazione

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La variabilità genetica

Il DNA può cambiare

Errori durante la

replicazione

Mutazioni

TrasposizioneTrasposizione

Mutazioni

Cambio casuale ma stabile ed

ereditabile

Letali

Negative

Positive

mutazioni da transizione= purina/purina

pirimidina/pirimidina

mutazioni da transversione= purina/pirimidina

delezione o inserzione di una base = frame

shift= Mutazioni puntiformi

L’espressione di una mutazione sarà rilevata solo se

produce un fenotipo alterato che può essere

riconosciuto

La lunghezza dei trasposoni noti è compresa tra 750

e 40000 coppie di basi e nei batteri

ne sono stati trovati di due tipi :

l’ordine dei geni può cambiare ?

TRASPOSONI

segmenti di

DNA mobili

SEMPLICI chiamati anche SEQUENZE DI

INSERIMENTO O DI INSERZIONE.INSERIMENTO O DI INSERZIONE.

Sequenze ripetute invertite= IR

TrasposasiIR IR

lunghezza media sequenze IS: 1000-1500 bp

lunghezza media IR: 10-25 bp

COMPLESSI

altri geniIR IR IR IR

sequenza IS sequenza IS

trasposone marcatori genetici

(bp)

Tn3 4957 Amp

Tn501 8200 Hg

Tn951 16500 Utilizzazione lattosio

Tn5 5700 Kc

Tn9 2500 Cm

Tn10 9300 Tet

Meccanismi di trasposizione:

Semplice o non replicativa: entrambi i filamenti del DNA originale si spostano insieme da una regione all’altra senza

replicarsi.

Replicativa: coinvolge la replicazione del DNA, una copia del trasposone rimane nel suo sito originario mentre l’altra si inserisce

in un nuovo locus.

Tn10 9300 Tet

Tn1681 2061 Enterotossina stabile al calore

Inattivazione del gene bersaglio

promotore DNA

mRNA

proteina

promotore DNA

mRNA

proteina assente o tronca

Attivazione di geni silenti

promotore

deboleDNA

gene non trascritto o scarsamente trascritto

promotore

forte

gene altamente trascritto

Endodesossiribonucleasi di restrizione = Endonucleasi = ER

Eco RI da E. coli 5’ –G-A-A-T-T-C--C-T-T-A-A-G-5’

Siti di restrizione=

Hae III da Haemophilus aegyptius 5’ –G-G-C-C-

La cellula può proteggersi dalle

variazioni?

Hae III da Haemophilus aegyptius 5’ –G-G-C-C--C-C-G-G-5’

Hpa II da Haemophilus parainfluenzae 5’ –C-C-G-G--G-G-C-C-5’

Fanno parte del sistema di MODIFICAZIONE/RESTRIZIONE presente in molte cellule batteriche

Come possiamo sfruttare in laboratorio le conoscenze sul DNA?

1° Estrazione e purificazione dalle cellule batteriche

2° Quantificazione e visualizzazione spettrofotometrica

3° Visualizzazione per via elettroforetica

Identificazione tassonomica: %GC e 4° Identificazione tassonomica: %GC e riassociazione molecolare DNA/DNA

5° Amplificazioni di porzioni specifiche del cromosoma

6° Riconoscimento a livello di specie e ceppo in funzione dello studio molecolare delle porzioni amplificate

Estrazione e purificazione dalle cellule batteriche

Raccolta e lavaggio delle cellule

Risospensione in tampone + saccarosio (6%)

Aggiunta di agente litico: lisozima (pH 7-8, 37°C per 30 min)

Aggiunta di tensioattivo: SDS al 20%

Deproteinizzazione mediante estrazione con solventi: fenolo, CHF/isoamilico

Centrifugazione e raccolta del surnatanteFase acquosa contenente il DNA

InterfaseInterfaseSolvente

Ulteriore deproteinizzazione e raccolta del surnatante

Trattamenti enzimatici con RNAsi e Proteinasi

Precipitazione del DNA con 2 vol. di EtOH

Scioglimento del DNA in tampone

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Quantificazione e visualizzazione spettrofotometrica

Il DNA ha un massimo di assorbimento a 260 nm

1 OD260nm = 50 µg/ml

Il DNA si denatura per effetto del calore = si rompono i legami Il DNA si denatura per effetto del calore = si rompono i legami H e si separano i due filamenti

Per l’EFFETTO IPERCROMICO delle basi nucleotidiche, all’aumentare della separazione dei due filamenti aumenta la OD260nm

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� una molecola carica posta all’interno di un campoelettrico migra in direzione del polo di caricaopposta

� in un gel costituito da un polimero organicomolecole di dimensioni diverse (ma di uguale carica)migrano con velocità diverse, perché le molecole didimensioni maggiori incontrano maggiore resistenzatra le maglie di un gel

Visualizzazione per via elettroforetica

È così possibile visualizzare il DNA facendolomigrare all’interno di un supporto solido (gel) ecolorandolo opportunamente

I REAGENTI DELL’ELETTROFORESI:

Tampone : crea continuità nella vaschetta

AGAROSIO: polimero che costituisce il gel

Indicatore DI CORSA: permette di visualizzare la corsa ed aumenta la densità della soluzione di DNA da inserire nelle taschine del gel

BROMURO di ETIDIO: si intercala tra le basi azotate delle molecole di DNA e lo ‘colora’

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LA STRUMENTAZIONE DELL’ELETTROFORESI:

1) ALIMENTATORE:

crea la differenza di potenziale

2) VASSOIO e VASCHETTA ELETTROFORETICA:ELETTROFORETICA:

vi si alloggia il gel, vi si instaura il campo elettrico

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POLO -

] bande di DNA

frammenti di lunghezza maggiore

frammenti di lunghezza minore

IL RISULTATO DI UNA CORSA ELETTROFORETICA

VISUALIZZAZIONE MEDIANTE TRANSILLUMINATORE A LUCE ULTRAVIOLETTA (254-312nm)

POLO +

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