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Strategie di analisi e di controllo dello sviluppo di Brettanomyces/Dekkera nell’industria enologica
Dott. Vincenzo Fabrizio
Riccagioia, 9 Novembre 2013
Analisi dei fabbisogni
Riccagioia, 09/11/2013
Elevato interesse nei confronti di Brettanomyces/Dekkera in funzione del ruolo negativo che svolgono nei confronti principalmente dei vini rossi da
affinamento.
Difficoltà nella gestione della contaminazione:
1. Sopravvivenza e moltiplicazione in condizioni proibitive per molti microrganismi;
2. Produzione di fenoli volatili con proprietà sensoriali sgradite e deprezzanti;
3. Le principali contromisure impiegate in cantina non sono sufficienti ad eradicare il problema;
4. Alcuni ceppi di Brettanomyces formano biofilm rendendo vane le procedure di sanificazione.
Aspetti tassonomici
Custer, 1940: genere Brettanomyces
Van der Walt, 1960: generi Dekkera/Brettanomyces
Dekkera, genere teleomorfico
Brettanomyces, genere anamorfico
Riccagioia, 09/11/2013
Specie di interesse enologico
GENERE FORMA TELEOMORFA
FORMA ANAMORFA
Dekkera/Brettanomyces
Dekkera anomala Brettanomyces anomalusDekkera bruxellensis Brettanomyces bruxellensis
Saccharomyces cerevisiaeDekkera/Brettanomyces
Riccagioia, 09/11/2013
Esigenze nutrizionali e ambientali
Genere Dekkera/Brettanomyces
Fonti di carbonio:
-Glucosio;
-Etanolo;
-Acidi cinnamici;
-Composti carbonilici del legno.
Azoto assimilabile
Ossigeno
Riccagioia, 09/11/2013
Range Temperatura: 13-30°C
Resistenze:
-Alcol;
-SO2
Aspetti fisio-metabolici: alcol-tolleranza
Fenomeno: stress da etanolo
modificazione delle membrane lipidiche
sintesi di proteine definite “da stress”: heat shock proteins
modulazione degli scambi ionici
Risposta allo stress
Aumento di acidi grassi insaturi a lunga catena
Incremento della concentrazione di trealosio
Riccagioia, 09/11/2013
Alcol-tolleranza
10%
12%
13%
Curva di crescita di D. bruxellensis ISA 1791 su YNB, glucosio 2% e in presenza di etanolo a concentrazione crescente:
= 4%= 6%= 8%
Riccagioia, 09/11/2013
Aspetti fisio-metabolici: produzione di acido acetico
Riccagioia, 09/11/2013
Soprattutto in presenza di ossigeno
si ha forte produzione di acido acetico
Aspetti fisio-metabolici: resistenza alla SO2
SO2 libera SO2 combinata
• SO2 molecolare • frazione parzialmente dissociata HSO3
-
• completamente dissociata o solfito SO32-
SO2
SO2 HSO3-
pH = 7.0
MOSTO:
pH < 3.5Reattività dei solfiti:
• sulle proteine: spezzando i ponti disolfuro, alterandone la struttura terziaria, modificazioni conformazionali degli enzimi, reagendo con cofattori e coenzimi;• sugli acidi nucleici: legandosi all’uracile e alla timina.
Riccagioia, 09/11/2013
Aspetti fisio-metabolici: utilizzazione del cellobioso
Le barriques nuove sono pressoché sterili grazie al trattamento di tostatura,tuttavia contengono cellobiosio, dimero del glucosio (β 1-4),
formatosi in conseguenza del trattamento termico, substrato fermentabile da Brettanomyces/Dekkera
Riccagioia, 09/11/2013
Aspetti tecnologici
Rischi correlati allo sviluppo di Brettanomyces in ambito enologico
QUALITATIVO: produzione di fenoli volatili
SICUREZZA: produzione di ammine biogene
Riccagioia, 09/11/2013
Produzione di fenoli volatili
cinnamato decarbossilasi
vinil-fenolo reduttasi
Riccagioia, 09/11/2013
Soglie di percezione dei fenoli volatili
composto in acqua (μg/L)
in vino bianco (μg/L)
in vino rosso (μg/L)
descrittore
4-vinil-fenolo 85 180 200
farmaceutico, fenolo
4-vinil-guaiacolo 30 150 570
speziato, chiodo di garofano
4-etil-fenolo 130 400 520
sudore di cavallo, stalla, animalesco
4-etil-guaiacolo 25 50 140
cerotto, plastica bruciata
Riccagioia, 09/11/2013
Incidenza di alterazione in vini rossi da affinamento
Riccagioia, 09/11/2013
Produzione di ammine biogene
Sc = Saccharomyces cerevisiae, Ka= Kloeckera apiculata, Cs= Candida stellata,
Mp=Metschnikowia pulcherrima, Bb=Brettanomyces bruxellensis
Limiti consentiti per l’importazione di ammine biogene totali
Svizzera: 10 mg/l
Francia: 8 mg/l (raccomandato)
Belgio: 6 mg/l
Germania: 2 mg/l
Riccagioia, 09/11/2013
Prevenzione e rimedi
Controllo della contaminazione in cantina da parte di fonti esterne:
- Ricezione uve tramogge, pigiadiraspatrici, pompe che possono divenire in breve tempo focolai di contaminazione.
Riccagioia, 09/11/2013
- Ricezione vini dall’esterno
Prevenzione e rimedi (2)
Valutazione dell’efficienza delle procedure di sanitizzazione, degli strumenti utilizzati per la vinificazione e lo stoccaggio,
nonché dei locali della cantina;PROVE DI MIC (Minima Concentrazione Inibente) al
fine di stabilire la concentrazione minima del detergente da usare, alla quale il microrganismo non è
più in grado di svilupparsi.
Riccagioia, 09/11/2013
Analisi microbiologica prima e dopo trattamento per valutarne
l’efficacia
Monitoraggio della contaminazione nelle fasi chiave del processo:
Prevenzione e rimedi (3)
• Monitoraggio microbiologico del mosto
• Monitoraggio microbiologico durante affinamento
• Monitoraggio microbiologico all’imbottigliamento
Riccagioia, 09/11/2013
Controllo della presenza di Brettanomyces
I metodi usuali: controllo microbiologico
terreni specifici e selettivi per Brettanomyces: DBDM
indicatori degli acidi organici (acetico in particolare)
rilevatori specifici dell’attività del microrganismo (precursori dei fenoli volatili)
Riccagioia, 09/11/2013
Controllo della presenza di Brettanomyces (2)
metodi innovativi: controllo biomolecolare
Pattern genetici specifici per le specie pericolose di Brettanomyces/Dekkera
PCR: primers specifici per il 26S rDNA di Brettanomyces
Analisi di restrizione dell’amplificato
Riccagioia, 09/11/2013
Brettanomyces
Controllo della presenza di Brettanomyces (3)
Sviluppi futuri
Real-Time PCR
Riccagioia, 09/11/2013
Analisi quantitativa associata ad analisi qualitativa; permetterà in futuro di ottenere analisi microbiologiche in tempo reale, quindi molto più simili alle
normali analisi chimiche di processo.
Attività effettuate a Riccagioia
Campionamenti: pompe, vasche, vini, barrique
Analisi fenotipiche e genotipiche al fine di confermare l’effetiva contaminazione da parte
di Brettanomyces
Valutazione delle procedure di sanificazione effettuate in azienda e redazione di nuove procedure igieniche per
eradicare il problema
Riccagioia, 09/11/2013
Conclusioni
• La prevenzione risulta essere sicuramente il miglior strumento nella lotta contro il Brettanomyces in cantina;
• La prevenzione si concretizza attuando le “Good Manufacturing Practices” ed effettuando controlli mirati nei
punti chiave del processo;
• L’analisi microbiologica diventa un strumento necessario nella gestione e nel monitoraggio di Brettanomyces, durante tutto
l’arco del processo produttivo;
• Riuscire a comprendere nell’immediato la problematica consente la messa a punto di rimedi che permettono di
eradicare il problema o comunque ridurne l’entità entro valori accettabili.
Riccagioia, 09/11/2013
GRAZIE PER L’ATTENZIONE