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LE NUOVE TERAPIE CELLULARI: IL LABORATORIO TRASLAZIONALE
CROAviano
Dr. Mario Moreno Mazzucato
Dipartimento di Ricerca Traslazionale
S.O.S.D TCS-TC (Stem Cell)
È una cellula capace di rinnovarsi, di
replicare se stessa per un tempo indefinito,
ma anche di dare origine a tutte le cellule
presenti nel sangue circolante».
Prof. Adolfo Ferrata, 1920: Emoistioblasto
A. Wilson: Ann. N.Y. Acad. Sci. 1106: 64–75
(2007). C 2007 New York Academy of
Sciences.
CD150+, CD34-,
CD45-
CD150+, CD34+, CD45+,
CXCR4, MPL
CD150+, CD34+, CD41+,
CXCR4, MPL
CD41+, CXCR4, MPL+,
VWF
CELLULE STAMINALI SONO RICHIAMATE DA TESSUTI
DANNEGGIATI
Trapianto di cuoreDonna(donatore)-uomo(ricevente
Cardiomiociti(actina sarcomerica)
Cromosoma Y
Muscolatura liscia(actina della muscolatura
liscia)
Cellule endoteliali(Fattore VIII)
Arterioli coronari
Cellule endoteliali(Fattore VIII)
Capillari venosi
PLASTICITA’ DELLE CELLULE STAMINALI ADULTE
DEFINIZIONE DI PLASTICITA’
Cellule staminali del midollo osseo, chenormalmente danno origine alle cellule maturedel sangue, possono, in opportune condizioni econ bassa frequenza, dare origine a cellulemuscolari scheletriche, cardiache o lisce,neuroni, epatociti e cellule epiteliali.
D.E. Discher: SCIENCE VOL 324 26 JUNE 2009
Fig. 1. Stem cell niche and designs. (A) Soluble and matrix-bound factors combine with cell-cell contact,
cell-matrix adhesion, and gradients to direct cell fate. (B) Substrates with micropatterns of ECM control the
size of ESC colonies and pluripotency based on immunofluorescence for the transcription factor Oct4 (in
two dimensions, 2D) (7). (Plot) Large islands increase the pluripotent population; small islands inhibit
with a time constant of 24 hours. (C) Substrates with microwells help to standardize the diameter of
quasi-spherical embryoid bodies (15). Cells and ECM (laminin) exhibit a spherically symmetric pattern
(in three dimensions, 3D), with pluripotent cells in the inside.
Fig. 2. Forces and ECM in stem cell trafficking. (A) To extravasate from the circulation and invade a tissue, stem cells must adhere
strongly to the vessel wall and withstand high flow forces. Within a tissue, additional physical factors can direct motile cells,
including durotaxis into stiff, fibrotic regions of tissue where cells engraft. (B) Soft tissue elasticity scale ranging from soft brain (72),
fat (73), and striated muscle (21), to stiff cartilage [E ≈ 20 to 30 kPa at the scale of adhesions (74, 75)] and precalcified bone (21).
(C) In vitro substrates that mimic soft and stiff tissue microenvironments (left) show that cells anchor more strongly to stiff
substrates, building focal adhesions and actin-myosin stress fibers. (Right) Matrix adhesion and growth factors influence both cell
physiology and lineage. Signals from growth factor receptors not only propagate into the nucleus (dashed blue arrow) and direct
transcription (black arrow), but also affect Rho-GTPase (guanosine triphosphatase) activity (dotted blue arrow). Rac drives motility
forward, and Rho regulates contraction of stress fibers (red), and both can also influence gene expression (dotted red arrow).D.E. Discher: SCIENCE VOL 324 26 JUNE 2009
Cell Differentiation
YAP/TAZ (transcription regulators) in mechanotransduction
Dupont S.; Nature, 2011; 474: 179-185
PATRIMONIO GENETICO COMUNE
CELLULA INDIFFERENZIATA(STAMINALE/TOTI-PLURIPOTENTE)
CELLULA DIFFERENZIATA(ESPRESSIONE DI GENI SPECIFICI)
DIFFERENZIAMENTODEDIFFERENZIAMENTORIPROGRAMMAZIONE
iPSCs?
Checkpoint
Stimoli esterni
Fattori di crescita
Adesione cellulare
Ligando recettore
Sintesi
STIMOLI AMBIENTALI
Checkpoint
Controllo DNA
Duplicato
Checkpoint
Danno del DNA
CheckpointVerifica del
Fuso mitotico
Figure 1. The Generation of iPSCs Is a Multistep Process that Can Be Modulated by Extracellular Cues and Reprogramming
Factor Levels. Known events occurring in early, middle, and late phases during the OSKM-mediated reprogramming of mouse
embryonic fibroblasts to iPSCs are depicted.During the final emergence of fully reprogrammed iPSCs, so-called
„„reprogramming-competent cells‟‟ appear to be inhibited by the continued expression of the factors. The reprogramming
process can be preferentially trapped in partially reprogrammed states when certain reprogramming factor levels and/or
stoichiometries are employed (top) or can be redirected to a different cell identity, without going through the pluripotent state, by
changing culture/growth factor conditions and timing of OSKM expression (bottom).
Bernadett Papp and Kathrin Plath: Cell 152, March 14, 2013
John B. Gurdon Shinya Yamanaka
Nobel 2012 per la Medicina
iPSC: cellule staminali pluripotenti indotte
Volume 4
EU Guidelines to
Good Manufacturing Practice
Medicinal Products for Human and Veterinary Use
TERAPIE CELLULARI
Cellule
staminaliProdotti medicinali a
base di cellule
Manipolazione
cellulare estensivaUso Clinico
PRODOTTO MEDICINALE PER TERAPIA CELLULARE (PTC)
“Si intende con Prodotto medicinale per Terapia Cellulare (PTC) ogni
preparazione che venga somministrata a un essere umano con finalità
analoghe ai Medicinali che contenga cellule vive o parti complesse di
esse, sia che queste siano somministrate da sole o insieme a
matrici/involucri di origine sintetica o biologica”.
LINEE GUIDA SUI PRODOTTI PER TERAPIA CELLULARE
Notiziario ISS volume 17, n° 7-8 Luglio-Agosto 2004
IL PERCORSO VIRTUOSO DI UN PRODOTTO DI TERAPIA CELLULARE
DAL LABORATORIO AL “LETTO DEL MALATO”
• Dati in modelli pre-clinici
• Validazione delle procedure in condizioni GMP
• Sottomissione ed approvazione del dossier di sperimentazione da parte
ISS o AIFA
• Approvazione del protocollo da parte del Comitato Etico locale
• Produzione GMP in una Cell Factory autorizzata dall‟ AIFA e dotata di
almeno una Qualified Person
• Registrazione di tutti i casi arruolati in studi clinici con PTC in un
registro nazionale
IL SISTEMA DI ASSICURAZIONE DELLA QUALITA‟
NELLA PRODUZIONE DI UN MEDICINALE
Materia prima
Processo produttivo
Controllo di qualità
Prodotto finale
Conformità con le
specifiche di rilascio
Sistema di assicurazione della qualità
sicurezza
qualità
efficacia
I MACROELEMENTI DELL’ASSICURAZIONE DELLA QUALITA’ (2)
Materia prima Prodotto finale
Training del
personale Documentazione
Standard
Pulizia e
sanitizzazione
Comportamento e
vestizione
Direttore MedicoQP: Mario Mazzucato
Responsabile Assicurazione Qualità:
Cristina Durante
Responsabile Qualità: Francesco Agostini (QP)
Responsabile Produzione: Stefania Zanolin
Organigramma “Cell Factory” CRO-IRCCS AVIANO
OP Produzione: Marco Valvasori
SettembreIncontro a Monza
DDG 111 21 giugnoAccordo con Monza
Luglio/Dicembre/Marzo2014Progettazione
Layout-User Requirements
Novembre/DicembreAddetsramento
Direttore e TLB Produzione
DicembreRinnovo Accordo
DDG 111 21 giugno 2013
Attività addestramento personale/Opere Strutturali
CRO-Aviano/Lab. “Stefano Verri” Monza
2012 2013 2014 2015 2016 2017
MarzoAddestramento
RQ/RAQ
Dicembre 2014Magazzino
criogenico di prodotto finito
Procedure di Gara
C.R.O.-IRCCS AvianoProtocolli clinici sperimentali di terapia avanzata
Cellule Mesenchimali(MSC)
Cytotoxic T-cell Lines(EBV-CTL)
Megacariociti(MKS)
Chimeric Antigen Receptor –T-Cell(CAR Cell)
Da Tessuto Adiposo
Da Sangue Midollare
Medicina Rigenerativa:
-Ricostruzione Mammaria
post mastectomia
-Ricostruzione Tessuti molli
post chirurgia oncologica
-Immunomodulante: GVHD
Autologo/Allogenico
Autologo -Linfomi EBV associati
Autologo/Allogenico -Piastrinopenie
iporigenerative
Autologo -Onco-ematologia,
Oncologia
Mundra V. et al.
Depositi adiposi (sottocutanei) facilmente accessibili con procedura semplice (liposuzione)
Procedura di raccolta sicura e ben tollerata, economica e poco invasiva
Rapporto Stem Cells/grammo tessuto estremamente elevato (fino a 2x10^5/grammo di tessuto adiposo, mille volte in più rispetto alle MSC del midollo osseo)
non necessitano di espansione ex-vivo
alta numerosità anche 1000 volte superiore rispetto a quelle del
midollo osseo
Cellule Mesenchimali da Tessuto Grasso
Grasso Liquido
Collagene/Adipociti/Detriti
Cellule pellet/eritrociti
Marco L. Davila et al.
HT-1080/NG2+
SUBSTRATE: Collagen Type VI
DISPOSITIVI IN GRADO DI FORNIRE UN AMBIENTEADEGUATO ALLA CRESCITA DI ORGANISMI BIOLOGICI
BIOREATTORI
AMBITI DI UTILIZZO:FarmaceuticaAlimentareEnergeticaDepurazioneBiotecnologieEcc……
BIOREATTORI
STATICI
DINAMICI
BIOMIMETICI
3D Flow Bioreactor
Pallotta et al.: TISSUE ENGINEERING:. 2011: 12 (17); 1223-1232
Megacariociti/Attivazione
Trombi piastrinici su collagene fibrillare più VWF (15mg/ml) efibrinogeno (100mg/ml), shear rate 50sec-1. Le piastrine sono stateprodotte da bioreattore a partire da megacariociti al 14 giorno dicultura.
2013 2014 2015 2016 2017
MSC
EBV-CTL
MKS
CAR Cell
Realizzo Cell Factory
Capitolato/Gara/Costruzione ?
Gene
Terapy
Cell
Terapy
Protocolli clinici sperimentali di terapia avanzata
Traslazione in GMP del protocollo sperimentale e iter autorizzativo AIFA
Produzione
Protocollo sperimentale fase di ricerca preclinica
CRO-Aviano/Lab. “Stefano Verri” Monza
Layout, User
Requirements
Cell FactoryC.R.O.-IRCCS Aviano
SOSTENIMENTO ECONOMICO/DIVULGATIVO
C.R.O.-IRCCSAviano
Fondazione CRO Aviano ONLUS
Associazioni Volontariato
AIL, AVIS, ADMO, AFDS, AIRC, ADISCO, Via di Natale
Soggetti /Enti Privati, Banche
Trasferimento Tecnologico
Progetto Obbiettivo
Smart ClotStem Cell
Fattori di crescitaintrapiastrinici
GRAZIE PER L’ATTENZIONE