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Jean-Denis Docquier
Laboratorio di Fisiologia e Biotecnologia dei Microrganismi Dipartimento di Biologia Molecolare
Policlinico "Le Scotte", Viale Bracci, II piano, V lotto Tel. 0577 23 3134
jddocquier@unisi.it
Elementi di Micologia
I° anno - Laurea Magistrale Farmacia - 2012-2013
Recupero lezioni Prof. Zazzi: 3 giugno, 9-11, aula 9 4 giugno, 9-11, aula 12 Appelli di esame (aula informatica): 19 giugno, 9-14. 4 luglio, 9-14. 19 luglio, 9-14. 5 settembre, 9-14. 23 settembre, 9-14.
Completa mancanza di tessuti differenziati e elementi
conduttori
Sistema riproduttivo attraverso elementi detti spore e non
attraverso uno stadio embrionale come avviene per piante e
animali
Ubiquitari in natura: • negli strati superficiali del suolo • come commensali di animali e piante
eucarioti immobili chemiosintetici eterotrofi (mancano di clorofilla e sono dipendenti dei composti organici per la nutrizione) parete cellulare rigida
uni o pluricellulari si riproducono per mezzo di spore aerobi (facoltativi) parassiti, saprofiti e simbionti
TALLO: corpo vegetativo di un fungo
Un lievito, Saccharmyces cerevisiae, è stato utilizzato fin dai tempi più remoti per processi alimentari come la lievitazione del pane, la fermentazione del vino e della birra
Penicillium italicum: muffa verde-blu che fa marcire le arance
Penicillium camemberti e P. rocqueforti giocano un ruolo fondamentale nella manufattura dei formaggi di tipo Camembert, Brie e Roquefort
Penicillum notatum e Penicillium chrysogenum, ed un suo metabolita, la penicillina, hanno consentito a Fleming nel 1928 di anticipare l’era antibiotica
Il Tolypocladium niveum produce clicloserina, un immunosoppressore utilizzato nella terapia della sclerosi e nei trapianti e alcuni lieviti vengono utilizzati in ingegneria genetica per la produzione di insulina
Aggregati
PLURICELLULARI
Funghi filamentosi o
MUFFE
L’insieme delle IFE viene detto
MICELIO
IFE
Ife non settate Ife settate
Micelio AEREO:
Strutture specializzate alla riproduzione
Conferisce l’aspetto tipico della colonia
Micelio VEGETATIVO:
Assorbimento di materiale nutritizio dal terreno
LA CELLULA FUNGINA
Capsula polisaccaridica (in alcuni casi)
PARETE CELLULARE RIGIDA
reticolo endoplasmico complesso di Golgi
nucleo compartimentato con cromosomi lineari
mitocondri
membrana plasmatica contenente ERGOSTEROLO
Citoplasma
Membrana plasmatica
Mannoproteine
Chitina (poli-NAG)
b–(1,3)-glucano
b–(1,6)-glucano
Struttura pluristratificata in livelli con particolari composizioni chimiche
Caratterizza la forma del micete
Proprietà antigeniche
Media interazioni con la cellula ospite
ergosterolo
Contiene ergosterolo
Controlla lo scambio di metaboliti con l’ambiente esterno
Coinvolta nella sintesi della parete cellulare
I miceti si riproducono per mezzo di strutture specializzate: SPORE o CONIDI
Due modalità di riproduzione:
sessuata
asessuata
Le due forme possono essere presenti, escludersi o alternarsi nel ciclo vitale di un fungo con ritmi e frequenze diversi nelle varie specie
Riproduzione per
GEMMAZIONE (budding yeasts):
BLASTOGONIA
Sistema in cui le cellule figlie compaiono come protuberanze dalla cellula madre dalla quale poi si distaccano diventando autonome, diversa dalla scissione perché avviene una ripartizione diseguale del citoplasma
Attraverso un processo mitotico vengono prodotte strutture specializzate denominate spore o conidi in grado di generare un nuovo individuo
I conidi hanno il vantaggio di essere molto leggeri, altamente resistenti, facile disseminazione ambientale
Conidiospore: i conidi si distaccano da un conidioforo posto su una ifa aerea
Sporangiospore: le spore vengono prodotte all’interno di un organo detto sporangioforo
Artrospore: le spore sono prodotte per frammentazione delle ife vegetative
Le spore asessuate possono essere:
La diversa morfologia dei conidi permette il riconoscimento delle varie specie di funghi filamentosi
Subordinata alla produzione di milioni di spore diffuse attraverso vento, acqua o insetti
La spora sessuale di un determinato sesso nelle condizioni più favorevoli germina formando un filamento di cellule detto micelio primario
Per poter completare il ciclo biologico e creare il micelio secondario l’ifa primaria generata da una spora con carica “maschile” si unisce una a carica sessuale opposta per formare il micelio secondario che genererà i corpi fruttiferi
Caratteristica peculiare di alcuni miceti patogeni
Capacità, reversibile, di presentarsi morfologicamente distinti
nella forma parassitaria o tessutale, in genere lievitiforme, e nella
forma colturale o vegetativa, in genere filamentosa
La conformazione è riferibile a:
scarso adattamento dei miceti alle condizioni ambientali (es. temperatura)
meccanismi di regolazione genica esercitati da temperatura, concentrazione ioni, variazioni pH
Abituali saprofiti, l’infezione rappresenta un evento accidentale
Molti prodotti considerati fattori di virulenza sono funzionali a scopi metabolici e riproduttivi
Nelle muffe il meccanismo principale è l’alta capacità di penetrazione nei tessuti e la capacità di adattarsi alle condizioni avverse dei tessuti parassitati
Resistenza alla fagocitosi:
dimensioni del tallo fungino
capacità di interferire con l’attività fagacitaria per presenza di strutture cellulari antifagocitarie: mannani (C. albicans), a 1-3 glucano (Blastomyces dermatitidis, H. capsulatum, P. brasiliensis), capsula (Cryptococcus neoformans), recettori del complemento che inibiscono l’opsonizzazione
Adesività:
meccanismi non specifici: forza idrofobiche, cariche elttrostatiche
meccanismi specifici: interazione tra adesine e recettori (chitina, glucani, mannani: possibili adesine)
Pleomorfismo: pluralità di forme (dimorfismo)
Produzione di tossine: alcune interferiscono con la risposta immunitaria
Candida albicans: canditossina, tossine a basso pm
Aspergillus spp.: aflatossina, gliotossina, fumigatossina, restrictocina
Produzione di enzimi idrolitici: proteasi (C. albicans), fosfolipasi, lipasi, serinproteasi (Aspergillus spp.), cheratinasi (dermatofiti), fenolo-ossidasi (Cryptococcus neoformans)
Barriere meccaniche
Sostanze antimicrobiche non specifiche
Fagocitosi e killing intracellulare
Immunità umorale e cellulo-mediata
Le specie fungine esplicano la patogenicità attraverso:
Parassitismo diretto (micosi)
Produzione di micotossine (intossicazioni micotossicosi)
Intossicazioni alimentari da ingestione di funghi macroscopici velenosi (micetismo)
Reazioni allergiche
La maggior parte delle infezioni da funghi sono lievi ed autolimitanti
Un numero limitato di funghi (generalmente dimorfici) possono causare malattia in soggetti altrimenti sani
MICOTOSSINE DI INTERESSE UMANO
Micotossine Effetto biologico Microrganismo
Aflatossina Carcinogenesi epatica A. parasiticus, A. flavus
Tricoteceni
Tossicità dermatologica; indebolimento del sistema immunitario; inibizione della sintesi proteica; effetto teratogeno
Fusarium, Acremonium, Stachyobotris, Trichoderma, Trichothecium, Verticimonosporium
Antrachinoni Epatotossico, carcinogenesi epatica
Penicillium, Aspergillus
Citreoviridine Neurotossica Penicillium
Naftochinoni Epatotossico Trychophyton, Penicillium viridicatum
Ocratossine Inibizione della tRNA sintetasi Aspergillus, Penicillium
Zearalenone Estrogenico, teratogeno Fusarium graminearum
Cloropeptide Epatotossico, diminuisce la sintesi del glicogeno epatico
Penicillium islandicum
Le micotossine possono esercitare effetti tossici acuti o cronici
Ne esistono numerosi tipi (B1, B2, G1, G2 e i loro derivati metabolici M1 ed M2). Sono fortemente sospettate di esplicare un’azione tossica, mutagena e cancerogena a carico del fegato e tossica per il sistema immunitario Difficili da eliminare perché sono organismi estremamente termoresistenti
Gli alimenti più esposti alla contaminazione sono i cereali (mais, frumento, riso, orzo, segale, ecc.) e derivati (farina e prodotti da forno, polenta ecc.), semi oleaginosi (arachidi,girasole, ecc.), frutta secca ed essiccata, legumi, spezie, caffé e cacao
Le condizioni ideali per lo sviluppo dell’aflatossina sono: 1. temperatura compresa tra 15 e 40 °C (optimum 20-25 °C) 2. umidità relativamente elevata superire al 70% 3. pH i cui valori siano compresi tra 4 e 8 4. presenza di ossigeno
Candida spp.
Cryptococcus neoformans
Malassezia spp.
Dermatofiti
Aspergillus spp.
Pneumocystis jirovecii (Pneumocystis carinii sp. f. hominis )
Miceti con dimorfismo temperatura-dipendente
Specie
Candida albicans Candida tropicalis Candida parapsilosis Candida glabrata Candida krusei
Specie clinicamente più rilevante
Altre specie clinicamente rilevanti
Habitat:
C. albicans: commensale umano distretti colonizzati: - cavo orale - intestino - vagina Altre specie: più frequentemente ambientali
(acque, suolo, vegetali)
Nei terreni di coltura in genere cresce come LIEVITO
Nei tessuti infetti sono possibili PSEUDOIFE e FORME FILAMENTOSE
Candida albicans può essere considerata un micete dimorfo
Micete lievitiforme (cresce bene a 25 - 37°C)
Habitat: saprofita molto diffuso nell’ambiente abbonda negli escrementi di piccione
Provvisto di abbondante CAPSULA POLISACCARIDICA - fattore di virulenza - colonie di aspetto mucoide - evidenziabile con inchiostro di china
Miceti filamentosi ad ampia diffusione ambientale
Caratteristica morfologia delle strutture conidiali
Il genere Aspergillus comprende varie specie: Aspergillus fumigatus (la specie clinicamente più importante) Aspergillus niger Aspergillus flavus
Distinguibili per caratteri macro- e microscopici
Aspergillus niger
SPECIE SUPERFICIE VERSO
A. clavatus Blu-verde Bianco, marrone con il tempo
A. flavus Giallo-verde Dorato, marrone-rosso
A. fumigatus Blu-verde al grigio Bianco fino al marrone
A. glaucus Verde con aree gialle Giallo fino al marrone
A. nidulans Verde, camoscio o giallo Rosso porpora fino a verde oliva
A. niger Nero Bianco al giallo
A. terreus Cannella fino al marrone Bianco al marrone
A. versicolor Inizialmente bianco, vira poi al giallo, marrone-rosso, verde pallido o rosa
Bianco al giallo o rosso porpora
A. flavus
Aspergillus fumigatus
VANTAGGI: - rapidità - semplicità
esame microscopico a fresco
esame microscopico dopo colorazione di Gram
esame microscopico dopo colorazione con lattofenolo
esame microscopico dopo colorazione con inchiostro di china
esame microscopico dopo colorazione con calcofluor
TERRENI DI COLTURA
Non selettivi Sabouraud dextrose agar: pH 5.6 favorisce la crescita dei miceti invece che dei batteri
SAB Heart infusion (SABHI): arricchito di nutrienti, adatto per Blastomyces e Histoplasma
Potato dextrose
Selettivi
Mycosel (SAB con antibiotici): cloramfenicolo; cyclohexamide inibiscono la crescita dei saprofiti
Chromagar: terreno cromogenico per lieviti
Czapek agar: usato nella coltivazione dei microrganismi capaci di utilizzare nitrogeno inorganico; raccomandato per l’isolamento di Aspergillus e Penicillium
Corn meal agar
MUFFE Identificazione microscopica in base ai conidi e conidiofori
LIEVITI mediante terreni cromogenici
mediante test biochimici
Caratteristiche di un antifungino ideale:
Bersaglio selettivo
Attività fungicida
Elevata potenza
Ampio spettro
Bassa tossicità
Scarse o assenti interazioni farmacologiche
Disponibili in numero molto minore degli antibatterici - più difficile trovarne data la natura eucariotica della cellula
fungina
- l’impatto delle infezioni fungine è minore di quello delle infezioni batteriche
• Antibiotici POLIENICI
• Chemioterapici AZOLICI
• Allilamine
• Griseofulvina
• 5'-Fluorocitosina
• Echinocandine
Amfotericina B (uso sistemico)
Nistatina (uso topico)
Il numero di doppi legami coniugati è direttamente proporzionale all’attività antifungina e inversamente proporzionale alla tossicità in cellule
di mammifero. I comporti con 7 doppi legami, come l’amfotericina B, non solo sono circa 10 volte più tossici per la cellula fungina, ma sono gli unici
che possono essere impiegati per terapie sistemiche nell’uomo
Relativa nefrotossicità (Amfotericina B) (migliorata dalle formulazioni liposomiali)
Meccanismo di azione: legame a membrane contenenti ergosterolo formazione di canali transmembranari (effetto permeabilizzante)
Amfotericina B è pochissimo solubile in acqua. Complessata con acido desossicolico per somministrarla ev. Più recentemente formulazioni complessate con lipidi e incapsulate in liposomi ne hanno diminuito la tossicità e permettono di avere livelli plasmatici più elevati del farmaco
SQUALENE Squalene epoxide LANOSTEROL 14-alpha-demethyl lanosterol Zymosterol Fecosterol ERGOSTEROL
Squalene epossidasi
Lanosterolo 14-alpha demetilasi
ALLILAMINE: Naftifina Terbinafina
AZOLI: Ketoconazolo Fluconazolo Itraconazolo Voriconazolo
Caratterizzate dalla presenza di un gruppo allilaminico (naftifina e terbinafina) Butenafina e tolnaftato vengono annoverati in questa classe anche se hanno struttura diversa perché accomunati dallo stesso meccanismo d’azione
Indicazioni: micosi cutanee e degli annessi (Dermatofizie) (il farmaco si concentra nella cute e negli annessi)
Meccanismo di azione: inibizione sintesi ergosterolo bersaglio: SQUALENE EPOSSIDASI
Gli azoli sono classificati come: 1. imidazoli se possiedono due atomi di azoto nell’anello azolico (ketoconazolo) 2. triazoli se contengono tre atomi di azoto (fluconazolo, itraconazolo e voriconazolo,
posaconazolo e ravuconazolo)
Meccanismo di azione: inibizione sintesi ergosterolo bersaglio: LANOSTEROLO DEMETILASI
I triazoli hanno tossicità minore degli imidazoli a causa della loro maggiore specificità per i citocromi P450 fungini rispetto a quelli delle cellule di mammiferi
Ridotta permeabilità che impedisce l’ingresso del farmaco nella cellula
Aumentata produzione enzima bersaglio Erg11p per incrementata espressione del gene codificante ERG11
Alterazioni enzima bersaglio per mutazioni che ne diminuiscono l’affinità con gli azoli
Pompe da efflusso che estrudono il farmaco e non ne permettono l’accumulo, sono pompe do tipo “ABC trasporter”
> Bassa tossicità
> Frequente l’insorgenza di resistenza a causa di mutazioni a carico dei tre enzimi chiave
Meccanismo di azione: Inibizione della sintesi degli acidi nucleici Inibizione della sintesi proteica
5-FLUOROCITOSINA 5-FLUOROURACILE Citosina deaminasi
5-FLUOROURIDINA TRIFOSFATO
incorporato nel RNA della cellula fungina e determina inibizione della sintesi proteica
5-FLUORODESOSSIURIDINA MONOFOSFATO
Inibitore della timidilato sintetasi, enzima chiave nella
sintesi del DNA
Trasportato all’interno della cellula ad opera dell’enzima citosina permeasi
Uridina monofosfato fosforilasi
Si pensa che si leghi con la proteina tubulina, interferendo con il corretto funzionamento del fuso mitotico e quindi interferisca con la divisione cellulare
Meccanismo di azione:
Indicazioni: micosi superficiali delle unghie
Ergosterolo
Meccanismo di azione: inibisce specificatamente la sintesi del b-1-3-D-glucano, componente essenziale per l’integrità della parete; provoca un’aumentata permeabilità della parete e la conseguente lisi della cellula
Cryptococcus neoformans non risulta sensibile Zygomycetes sono naturalmente resistenti