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Enzimi: concetti di base e meccanismi di catalisi enzimatica
a. Classificazione, meccanismo d’azione
b. Esempi di reazioni catalizzate
c. Descrizione di alcune tipiche proteine enzimatiche.
Cofattori e vitaminea. caratteri generali, funzioni, effetti biologici b. regolazioni metaboliche delle vitamine A, D, E, F, K,
B1, B2, B3, B6, B8, B12, C, H, PP; c. trasformazione di vitamine in coenzimi.
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Gli enzimi
Gli enzimi promuovono effetti catalitici. Possono essere proteine semplici ma spesso possiedono un gruppo prostetico che è fondamentale per la regolazione degli effetti catalitici.Quando siamo in presenza di un enzima che sia una proteina coniugata si indica:
OloenzimaOloenzima= = apoenzimaapoenzima++coenzimacoenzima
Apoenzima: parte proteica semplice, alcuni enzimi sono solo apoenzimiCoenzima: gruppo prostetico, parte non proteica (derivato da una vitamina o metallo) che determina gli effetti catalitici
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Classificazione degli enzimi
Sono stati individuati 6 tipi fondamentali di reazioni enzimatiche:1.OSSIDOREDUTTASICHE (trasporto di elettroni)2.TRANSFERASICHE (trasferimento di gruppi)3.IDROLASICHE (scissione o resintesi con partecipazione di H2O)4. LIASICHE (formazione o scissione reversibile di legami)5. ISOMERASICHE (isomerizzazione del substrato)6. LIGASICHE (sintesi irreversibile di legami con consumo di
composti ad alta energia)
Sono di conseguenza state individuate 6 classi di enzimi, una per ciascuna delle reazioni suindicate.
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Classificazione degli enzimi
Ogni enzima è classificato con un codice a 4 cifre: a. b. c. da: si riferisce alla classe (reazione catalizzata, es. 4. liasi)b-c: si riferiscono alla modalità della catalisi e individuano la sottoclasse e la sotto-sottoclassed: numero di serie dell’enzima all’interno della sotto-sottoclasse.
Consideriamo ora una classificazione ordinata
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1. OSSIDOREDUTTASI
Trasportano unità riducenti, (H+)+(e-)La sottoclasse indica il donatore dell’H (alcool, aldeide ecc.) o altre unità riducenti (es. alcooldeidrogenasi). I vari numeri indicano i vari tipi di substrato che possono donare unità riducenti. Il 3° numero indica l’accettore delle unità riducenti (NAD+, FAD, Citocromo ecc) (es. alcooldeidrogenasi: accettori sono enzimi del metabolismo lipidico oppure citocromi, il numero progressivo individua la reazione). Il 4° numero indica il numero di serie nella sotto-sottoclasse.
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1. OSSIDOREDUTTASI: coenzimi
Le ossidoreduttasi sono proteine coniugate (apoenzima + coenzima). Il coenzima deriva dalla trasformazione da una vitamina oppure è una struttura che la cellula è in grado di prodursi: per esempio le strutture tetrapirroliche del protoemo nei citocromi.Nel dettaglio vedremo le caratteristiche di reazione di ossidoriduttasi di tipo:
PIRIDINICO (coenzima derivato dalla VITAMINA PP)FLAVINICO (coenzima derivato dalla VITAMINA B2 )CHINONICO (coenzima Q oppure derivato dalle VITAMINE E, K )PTERINICO (coenzima derivato dalla VITAMINA B8 )VITAMINA C DIPENDENTI
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OSSIDOREDUTTASI con coenzima PIRIDINICO (NAD+ e NADP +)
I coenzimi piridinici utilizzati da questa classe di ossidoreduttasiderivano dalla vitamina PP
3
2
4
N1
5
6
O
NH2
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N
C
O
NH2 VITAMINA PP
N
C
O
NH2
-OH
NH3
[1]Ne sono dipendenti molti animali e molti eucarioti. E’ l’eterociclo della piridina che in posizione 3 ha un gruppo amidicoSi tratta dell’amide dell’acido nicotinico [1]: dopo l’assunzione abbiamo l’idrolisi del legame amidico e quindi liberazione dell’acido nicotinico [2] che servirà per la sintesi del coenzima. In caso di deficienza soltanto le cellule animali hanno selezionato un sistema di supporto che utilizza gli intermedi del metabolismo del triptofano per sintetizzare un acido dicarbossilico ciclico: l’acido chinolinico [3].
N
C
O
OH
[2]
N
C
O
OH
C
O
OH
[3]
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COSTRUZIONE DEL COENZIMA PIRIDINICO [1]
Per la costruzione del coenzima sono necessari l’eterociclo della piridina, mono o disostituito con il carbossile (ACIDO NICOTINICO O CHINOLINICO). Inoltre è necessario, un saccaride, il RIBOSO. Si ottiene nella forma fosforilata sulla posizione 5 e con difosforilazionecon l’anidride esterna dell’acido fosforico sulla posizione 1.
O
OH
P O
OH
OH
H
OH
H2C
H
P
O
O
OHOH
O
OPOH
OH
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N
C
O
OH
ACIDO NICOTINICO RIBOSO-5-FOSFATO-1-PIROFOSFATO
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COSTRUZIONE DEL COENZIMA PIRIDINICO [2]
In questi enzimi avremo quei metalli di transizione (Me) che sono in grado di dare legami dativi con l’atomo di ossigeno che in seguito diventano legami covalenti: questo effetto si compie sull’O legato al C1 del riboso: viene sottratta la struttura pirofosforica sulla posizione 1 su cui compare una carica +: il C1 diventa C+, in contemporanea si ha una inversione di configurazione del C1 da α a β.Il C1+ può quindi ricevere attacco nucleofilo dal N1 del substrato (acido nicotinico o acido chinolinico). Si forma il prodotto di addizione e viene eliminato del pirofosfato (PPi).
O
OH
P O
OH
OH
H
OH
H2C
H
P
O
O
OHOH
O
OPOH
OHN
C
O
OH
+
Me
CH+ O
H
OH
H
OH
H2C
H
P
O
O
OHOH
N
C
O
OH
+ PPi
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COSTRUZIONE DEL COENZIMA PIRIDINICO [3]La struttura che si forma è costituita da un pentoso legato all’acido fosforico (in posizione 5 del riboso) e ad un’eterociclo azotato (o base azotata) tramite legame del C1 del riboso con l’N1 dell’eterociclo. Possiamo definire questa struttura un nucleotide: il nicotinato mononucleotide (NMN) oppure il chinolinato mononucleotide (CMN).
OH
OH
H
OH
CH2O P
H
N+
COOH
COOH
CMN
OH
OH
H
OH
CH2O P
H
N+
COOH
NMN
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COSTRUZIONE DEL COENZIMA PIRIDINICO [4]
Il chinolinato mononucleotide viene ulteriormente modificato da un metalloenzima Mn dipendente che riconosce il COOH in posizione 2 dell’eterociclo e lo sottrae sotto forma di CO2, generando quindi il nicotinato mononucleotide che serve per la formazione del coenzimafunzionale.
OH
OH
H
OH
CH2O P
H
N+
COOH
COOH
Mn
OH
OH
H
OH
CH2O P
H
N+
COOH
+ CO2
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COSTRUZIONE DEL COENZIMA PIRIDINICO [5]La sintesi del coenzima prevede una ulteriore reazione del nicotinato mononucleotide con ATP:
un Mn enzima riconosce l’ossigeno del legame di anidride che collega il Pα con il Pβ e destabilizza il legame tramite la transizione dativo-covalente dell’interazione Mn-O. Il Pα diventa sede di una carica + su cui da attacco nucleofilo uno degli atomi di ossigeno del fosforile del nicotinato. Quando il legame Mn-O ritorna dativo si libera pirofosfato e il prodotto di condensazione: il nicotinato adenin dinucleotide, ossia la forma desaminatadel NAD+ (desamido-NAD+).
N
N
N
N
NH2
OO
OHOH
P
O
OHP
O
OOH
OHOH
O
O
PN
N
N
N
NH2
OO
OHOH
P+O
OH
N+
COOH
OO
OH OH
OH
OHO P
Mn
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COSTRUZIONE DEL COENZIMA PIRIDINICO [6]
Per ottenere la forma attiva del coenzima (NAD+) si ha la seguente reazione:desamidoNAD+ + ATP + Q → ADP + Pi +E + NAD+
La reazione si basa sulla destabilizzazione del legame amidico della glutammina(Q) che viene scomposta a acido glutammico e un gruppo amminico che si trasferisce sul carbossile dell’acido nicotinico che torna quindi a formare una nicotinamide.Si ottiene il primo coenzima piridinico attivo, il NICOTINAMIDE ADENIN DINUCLEOTIDE (NAD+).
NAD+
O
N+
OO
OH OH
OH
O P
NH2
N
N
N
N
NH2
OO
OH
P
O
OHO
OH
O
N+
OO
OH OH
OH
O PN
N
N
N
NH2
OO
OH
P
O
OHO
OH
OH
desamidoNAD+
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COSTRUZIONE DEL COENZIMA PIRIDINICO [7]
L’altro coenzima piridinico attivo si ottiene dal NAD+ tramite fosforilazionedella posizione 2 del riboso legato all’anello purinico dell’adenina.
NAD+ + ATP → ADP + NADP+
I due coenzimi hanno identico meccanimo di azione ma sono caratterizzati da un differente pH isoionico ed isoelettrico, poiché uno (il NADP+ ) contiene un gruppo fosforico e ha quindi una carica netta negativa maggiore. Questi coenzimi interagiranno quindi con proteine che hanno simmetricamente un diverso pH isoelettrico ed eventualmente cariche positive complementari a quelle del coenzima. Alcune apoproteine si legheranno in modo specifico al NAD+ e altre al NADP+ a formare differenti oloenzimi ossidoreduttasici piridinici.
O
N+
OO
OH OH
OH
O P
NH2
N
N
N
N
NH2
OO
OH
P
O
OHO
PO
O
OH
OH
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Struttura trimensionaledel coenzima
La molecola da un punto di vista spaziale risulta ripiegata intorno ad un asse in corrispondenza dell’O che connette i due gruppi fosforici. I due eterocicli si trovano su piani affacciati e paralleli. Tra i due piani si collocano i metalli cofattori, ioni
metallici bivalenti (Ca2+ Mg2+ Mn2+ ), effettori della catalisi, che danno 4 interazioni con gli atomi indicati dagli asterischi *
O
N+
OO
OH OH
OH
O P
NH2
N
N
N
N
NH2
OO
OH
P
O
OHO
OH
*
*
**
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Effetto catalitico
I metalli cofattori catalizzano la ridistribuzione del sistema di insaturazioni: la adenina transisce dalla forma lattimica alla forma semilattamica, e questo effetto, amplificato dai metalli cofattori si trasmette alla piridina, che verrà a trovarsi in 2 possibili forme di risonanza: la aromatoide e la chinoide.
N
O
NH2
+
H
CH3
N
O
NH2
H
Chinoide (NAD(P)H + H+)
+ H + elettrone
Aromatoide (NAD(P)+)
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Effetto catalitico
La transizione scatenata dall’equilibrio tra le due forme di risonanza fa sì che sulla posizione 4 si concentri la carica positiva portata in precedente dall’N e che possa essere fissato in 4 un atomo di idrogeno in più mentre un elettrone viene accettato dal sistema delocalizzato degli anelli. Si forma pertanto una struttura neutra.
Le ossidoreduttasi che contengono questi coenzimi operano reversibilmente, catalizzando la riduzione o l’ossidazione dei substrati.
NAD+
NADP++ XH2
ossidazione
riduzioneX +
NADH + H+
NADPH + H+
La catalisi è stereospecifica: il substrato interagisce con il coenzimasolo solo se si trova in una conformazione sterica appropriata.
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Interazione coenzima-apoproteina
L’interazione con la proteina è esclusivamente salina, il coenzima si lega all’apoproteina tramite interazioni dei fosforili del pirofosfato. Nei coenzimi NADP viene coinvolto anche il gruppo fosforico presente in 2’. Gli enzimi che interagiscono con NAD o NADP hanno pH isoelettrico differente.
Nelle cellule eucariotiche:I coenzimi NAD sono presenti in enzimi intra-mitocondriali.I coenzimi NADP in enzimi extra-mitocondriali
Eccezione: le ossidoreduttasi della glicolisi utilizzano NAD anche se la glicolisi è extra-mitocondriale.
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Interazione coenzima-apoproteina
•Durante il trasferimento delle unità riducenti si realizzano nel sito attivo dell’enzima dei cambiamenti conformazionali che fanno variare la costante di dissociazione (Kd) tra coenzima e apoproteina, fino a farla aumentare di un fattore 103-104
•Il coenzima trasformato dissocia (infatti all’aumentare della Kd diminuisce l’affinità del coenzima per la apoproteina) e lo stesso enzima trasformato può essere accettato da un’altra apoproteina che lo utilizzerà per una reazione spostata in verso opposto rispetto alla precedente
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Substrati delle ossidoreduttasi con coenzimi piridinici. Tipo 1
Coinvolgono unità MONOCARBONIOSE (gruppi con un solo atomo di carbonio).
CH-OH alcool 2ario + NAD+ C=O (chetone) + NADH + H+
CH2-OH alcool 1ario + NAD+ CHO (aldeide) + NADH + H+
CHO aldeide + NAD+ COOH (carbossile) + NADH + H+
COOH carbossile: può essere ossidato a CO2 o ridotto a -CHO
il gruppo aminico può andare incontro a desaminazione ossidativa
H2N-C-H + NAD+ C=NH (immino gruppo) + NADH + H+
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Esempio: passagio aldeide-acido
E0 + NAD+ E1- NAD+ + R-C-OH E2- NAD+
E3- NADH E4-Zn + NADH + H3PO4 E5-Zn
SH
OH
HS
R-C-OHH
SR-C=O
SR-C=O
S+ R-C-OP
O
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Substrati delle ossidoreduttasi con coenzimi piridinici. Tipo 2
Alcune ossidoreduttasi NAD dipendenti hanno potenziale standard che consente l’interazione diretta con altre ossidoreduttasi.
In particolare si ha l’interazione con enzimi redox che hanno coenzimi flavinici.
FADH2 FAD + NAD(P)+ + NAD(P)H + H+
FMNH2 FMN
E’ IMPORTANTE PER LE CATENE REDOX, es. catena respiratoria
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Substrati delle ossidoreduttasi concoenzimi piridinici. Tipo 3
Possono interagire con l’ossigeno molecolare NAD(P)H + H+ + O2 NAD(P)+ + OH- + OH•Si tratta di MONO-OSSIGENASI
Si forma un radicale OH• e a questo punto l’enzima puòospitare nel sito attivo il substrato su cui avviene una sostituzione radicalica ad opera del radicale OH•(ossigenazione). Es. un gruppo metilenico diventa un alcol.
Alcuni batteri che operano per il disinquinamento trasformano gli idrocarburi in alcoli che sono poi in grado di metabolizzare.