Post on 02-May-2015
transcript
Facoltà di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali
Laurea in Biologia e Tecnologie Cellulari
IL RUOLO DI UNA FAMIGLIA DI MAP CHINASI CHINASI CHINASI DI ARABIDOPSIS THALIANA NELLO SVILUPPO
Mario Larosaa.a. 2013/2014
LA TRASDUZIONE DEL SEGNALE MEDIATA DALLA CASCATA DELLE CHINASI ATTIVATE DA MITOGENO (MAPK) È UN MECCANISMO ALTAMENTE CONSERVATO NEGLI EUCARIOTI
Stimolo
MAPKKK
MAPKK
MAPK
Crescita e Sviluppo
Immunità
20 MAPK
Nel genoma di Arabidopsis 80 MAPKKK
10 MAPKK
LE MAP CHINASI CHINASI CHINASI DI ARABIDOPSIS
(Adattata da Champion et al., 2004)
La famiglia genica ANP è costituita da tre membri: ANP1, ANP2 ed ANP3
• Sono ridondanti funzionalmente: singoli mutanti knockout (KO) non differiscono dal WT, mentre solo il doppio KO anp2 anp3 mostra evidenti difetti nello sviluppo e nella citochinesi
Il triplo mutante KO è letale:
le ANP sono COLLETTIVAMENTE ESSENZIALI nello sviluppo
della pianta
• Sono stati identificati per la loro omologia con NUCLEUS– AND PHRAGMOPLAST-ASSOCIATED PROTEIN KINASE1 (NPK1) di tabacco
LA FAMIGLIA DELLE “ARABIDOPSIS NPK1-RELATED PROTEIN KINASE” (ANP)
(Adattata da Krysan et al., 2002)
amiR1
0.05 1 5 10
Wt
DMSO
2.5 5 10 20
β-estradiolo (nM)
amiR3
DMSO β-estradiolo (µM)
TRIPLI MUTANTI CONDIZIONALI anp
pri-amiRANP1 espresso nel doppio KO anp2 anp3
(fenotipo alterato nello sviluppo)
(fenotipo normale)
Silenziamento genico mediato da microRNA artificiali (amiR) inducibili da β-estradiolo
pri-amiRANP3 espresso nel doppio KO anp1 anp2
LA PARETE CELLULARE VEGETALE
(Adattata da Malinovsky et al., 2014b)
La parete primaria è costituita da:
Componenti microfibrillari
Componenti matriciali
Cellulosa
Emicellulose
Pectine
(Adattata da Bellincampi et al., 2014)
(Adattata da Szymanski e Cosgrove, 2014)
Un danno alla parete cellulare (Cell Wall Damage, CWD) può essere causato da:
Enzimi litici rilasciati da un patogeno durante l’infezione
Stress fisici
Agenti chimici
STRESS BIOTICI E ABIOTICI POSSONO ALTERARE L’INTEGRITÀ DELLA PARETE CELLULARE IN ARABIDOPSIS THALIANA
(Adattata da Levin, 2011)
La cascata delle MAPK media la segnalazione attivata dalla percezione del danno alla parete
nel lievito
IL MECCANISMO DI MANTENIMENTO DELL’INTEGRITÀ DELLA PARETE CELLULARE IN SACCHAROMYCES CEREVISIAE
OBIETTIVO DELLA TESI
Caratterizzazione del ruolo delle ANP nello sviluppo della radice
e nel mantenimento dell’integrità della parete cellulare di Arabidopsis thaliana
Plantule di sette giorni
LA MANCANZA DELLE ANP PROVOCA L’ESPANSIONE CELLULARE RADIALE NELLA RADICE
Wt 1 μM β
amiR320 nM β
amiR11 µM β
amiR3DMSO
LE RADICI DEI TRIPLI MUTANTI RISULTANO SIMILI A QUELLE DI PLANTULE WT TRATTATE CON L’ERBICIDA ISOXABEN (IXB)
Wt 20 nM IXB amiR3 1 μM β
Plantule di sette giorni
(N-[3-(1-Etil-1-metilpropil)-5-isoxazolil]-2,6-dimetossibenzamide)
L’ISOXABEN È UN AGENTE MODELLO PER LO STUDIO DEL DANNO ALLA PARETE CELLULARE VEGETALE
(Adattata da De Bolt, 2007)
Piante trattate con IXB presentano un minore contenuto di cellulosa
L’IXB induce il danno alla parete cellulare vegetale
Differenti Cellulosa Sintasi A (CESA) sono bersagli dell’azione dell’IXB
E’ un potente inibitore della biosintesi di cellulosa
(Paredez et al., 2006)
(Bischoff et al., 2009)
Alcohol-Insoluble Solid (AIS)
AIS de-amilato
Radici di plantule di dodici giorni
Estrazione Chelating Agent-Soluble Solid
(ChASS)
Analisi emicellulose
Residuo
Estrazione con 0.1 M KOH e 4 M KOH
Analisi degli zuccheri totali
Trattamento con acido trifluoroacetico e soluzione
di Updegraff
Analisi Cellulosa cristallina
ANALISI DELLA COMPOSIZIONE POLISACCARIDICA DELLE PARETI CELLULARI DEI TRIPLI MUTANTI E DEL WT TRATTATO CON ISOXABEN
WtWt β-estradiolo (1 μM)
Wt IXB (20 nM)amiR1 β-estradiolo (1 μM) amiR3 β-estradiolo (1 μM)
Analisi Pectine
LE RADICI DEI TRIPLI MUTANTI, COME LE PLANTULE WT TRATTATE CON IXB, CONTENGONO MENO ZUCCHERI TOTALI
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
WtIXB - + - - - -
--+ + - +β
amiR1 amiR3
g Z
ucch
eri t
otal
i/m
g AI
S de
-am
ilato
* * *
Alcohol-Insoluble Solid (AIS)
AIS de-amilato
Radici di plantule di dodici giorni
Estrazione Chelating Agent-Soluble Solid
(ChASS)
Analisi emicellulose
Residuo
Estrazione con 0.1 M KOH e 4 M KOH
Analisi degli zuccheri totali
Trattamento con acido trifluoroacetico e soluzione
di Updegraff
Analisi Cellulosa cristallina
ANALISI DELLA COMPOSIZIONE POLISACCARIDICA DELLE PARETI CELLULARI DEI TRIPLI MUTANTI E DEL WT TRATTATO CON ISOXABEN
WtWt β-estradiolo (1 μM)
Wt IXB (20 nM)amiR1 β-estradiolo (1 μM) amiR3 β-estradiolo (1 μM)
Analisi Pectine
LE RADICI DEI TRIPLI MUTANTI, COME LE PLANTULE WT TRATTATE CON IXB, CONTENGONO MENO CELLULOSA CRISTALLINA RISPETTO AL WT
0
2
4
6
8
10
12
14
Wt amiR1 amiR3
Ce
llulo
sa c
rista
llin
a
(g
g
luco
sio
m
g-1 A
IS d
e-a
mila
to)
β - -- -+ + +
IXB - - + - - - -
**
**
Alcohol-Insoluble Solid (AIS)
AIS de-amilato
Radici di plantule di dodici giorni
Estrazione Chelating Agent-Soluble Solid
(ChASS)
Analisi emicellulose
Residuo
Estrazione con 0.1 M KOH e 4 M KOH
Analisi degli zuccheri totali
Trattamento con acido trifluoroacetico e soluzione
di Updegraff
Analisi Cellulosa cristallina
ANALISI DELLA COMPOSIZIONE POLISACCARIDICA DELLE PARETI CELLULARI DEI TRIPLI MUTANTI E DEL WT TRATTATO CON ISOXABEN
WtWt β-estradiolo (1 μM)
Wt IXB (20 nM)amiR1 β-estradiolo (1 μM) amiR3 β-estradiolo (1 μM)
Analisi Pectine
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
*
* *
g Z
ucch
eri 0
.1M
KO
H/z
ucch
eri t
otal
i
Wt- + - - - -
--+ + - +
amiR1 amiR3
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
g Z
ucch
eri 4
M K
OH
/ zuc
cher
i tot
ali
Wt- + - - - -
--+ + +
amiR1 amiR3
Frazione pectica Frazione emicellulosica
-
Nella frazione emicellulosica estratta con KOH 4 M non ci sono differenze significative
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
* * *
g Z
ucch
eri C
hASS
/zuc
cher
i tot
ali
WtIXB - + - - - -
--+ + - +β
amiR1 amiR3
-
LE RADICI DEI TRIPLI MUTANTI, COME LE PLANTULE WT TRATTATE CON IXB, CONTENGONO MENO PECTINE MA POSSIEDONO PIÙ EMICELLULOSE ESTRAIBILI CON KOH 0.1 M RISPETTO AL WT
LA SINDROME DA DANNO ALLA PARETE CELLULARE (CELL WALL DAMAGE SYNDROME - CWDS) IN ARABIDOPSIS
(Adattate da Denness et al., 2011)
La percezione del danno alla parete porta ad una serie di risposte come l’aumento di specie reattive dell’ossigeno (ROS), la deposizione ectopica di lignina e l’accumulo del fitormone acido jasmonico.
Lignina
IXB
Cell Wall Damage
ROS Acido jasmonico
00.010.020.030.040.050.060.07
Wt amiR3amiR11 µM β - - -+ + +
0.080.09
nmol
H20
2/m
g p
eso
fres
co /m
l
I TRIPLI MUTANTI MOSTRANO UN MAGGIORE ACCUMULO DI ROS EXTRACELLULARE ED UNA DEPOSIZIONE ECTOPICA DI LIGNINA
10 nM
βDMSO
Wt amiR3
20 nM
IXB
10 nM
β
Uni
tà A
rbitr
arie
(x1
0-3)
0.5
1.5
0
1
2
0
0.20.4
0.60.8
1
1.21.41.6
02468
1012141618PDF1.2 ERF1 THI2.1
10 nM β - -+ + - -+ + - -+ +
amiR3Wt amiR3Wt amiR3Wt
I TRIPLI MUTANTI MOSTRANO UNA MAGGIOR ESPRESSIONE BASALE DEI GENI REGOLATI POSITIVAMENTE DALL’ACIDO JASMONICO
LA FAMIGLIA GENICA ANP È RICHIESTA PER IL MANTENIMENTO DELL’INTEGRITÀ STRUTTURALE DELLA PARETE IN ARABIDOPSIS
ANP
Cellulosa cristallina
Pectine
Emicellulose
Alterazione nella composizione della parete cellulare
ROS JA
Lignina nella radice
CWDS
Cellulosa cristallina
Pectine
Emicellulose
Alterazione nella composizione della parete cellulare
ROS JA
Lignina nella radice
CWDS
IXB
TALI ALTERAZIONI SONO MOLTO SIMILI AL TRATTAMENTO DEL WT CON L’ERBICIDA ISOXABEN
LE ANP SONO IMPLICATE NELLA RISPOSTA ALL’ISOXABEN
0
10
20
30
40
50
60
70
Wt anp1anp2
anp1anp3
anp2anp3
% in
ibiz
ione
del
l’allu
ngam
ento
del
la ra
dice
*
* *
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Wt
ANP1
SE
ANP3
SE
% in
ibiz
ione
del
l’allu
ngam
ento
del
la ra
dice
*
*
I doppi mutanti mostrano una minore sensibilità all’IXB al contrario dei mutanti sovraesprimenti le ANP, che risultano maggiormente sensibili all’erbicida
CONCLUSIONI
• La famiglia genica ANP è richiesta per il mantenimento dell’integrità strutturale della parete in Arabidopsis
• I tripli mutanti anp, al pari delle piante WT trattate con IXB, mostrano la sindrome da danno alla parete
• Le ANP sono richieste per la risposta al trattamento con l’IXB
Le ANP sono le prime MAPKKK note per esser coinvolte nel mantenimento dell’integrità della parete cellulare vegetale
Tra i futuri obiettivi dello studio di questa famiglia genica figurano:
Caratterizzazione della localizzazione subcellulare
Identificazione dei loro diretti interattori
PROSPETTIVE