Post on 06-Feb-2018
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CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA
PRESSIONE
•Tipi di cromatografo
•Unità di pressione
•Fase mobile
•Rivelatori
•HPLC di adsorbimento
•HPLC di ripartizione
Mauro Sabella
La cromatografia ad alta pressione HPLC (High Performance Liquid
Chromatography o High Pressure Liquid Chromatography) si basa sui
principi generali della cromatografia d’adsorbimento, di ripartizione, di
scambio ionico ecc.; essa permette di analizzare miscele difficilmente
risolvibili con le tradizionali cromatografie.
Le colonne HPLC hanno una maggiore risoluzione dovuta all’impiego di
fasi stazionarie molto finemente suddivise allo scopo di realizzare una
superficie di interazione molto grande ed un migliore impaccamento,
questo comporta che la fase mobile attraversi la fase stazionaria della
colonna ad una pressione molto alta per permettere una eluizione
accettabile nel tempo. Per una simile tecnica cromatografica, la fase
stazionaria, che presenta una granulometria generalmente compresa
tra 5-10 mm, deve avere requisiti particolari per adattarsi al tipo di
separazione da effettuare ed inoltre deve avere come requisiti
indispensabili:
a) essere stabile idroliticamente e termicamente;
b) resistere all’azione meccanica del flusso dell’eluente.
Mauro Sabella
Diversamente dalla gascromatografia, l’HPLC non separa
sostanze che si trovano allo stato di vapore, ma permette la
separazione di tutte quelle sostanze che difficilmente possono
essere vaporizzabili o che in ogni modo possano alterarsi ad una
temperatura più alta di quella ambiente; si può affermare che la
gascromatografia e l’HPLC sono due tecniche cromatografiche
che si completano a vicenda in quanto permettono di separare i
costituenti di una qualsiasi miscela.
I vantaggi dell’HPLC possono essere cosi riassunti:
1. tempi brevi d’esecuzione
2. riproducibilità delle condizioni sperimentali
3. le colonne possono essere usate più volte;
4. possono essere analizzate miscele di sostanze termolabili,
esplosive e non volatili.
5. possono essere evidenziate piccolissime quantità di sostanze
grazie all’alta sensibilità dei rivelatori che si utilizzano;
6. semplicità d’uso
Mauro Sabella
SCHEMA DI UN HPLC
Mauro Sabella
HPLC IN ISOCRATICA
Mauro Sabella
HPLC A GRADIENTE
Mauro Sabella
Le caratteristiche di uno strumento HPLC sono
rappresentate nello schema a blocchi delle figure. II
solvente opportunamente filtrato e depurato, viene inviato
alla colonna; questa operazione viene effettuata tramite
una pompa. Un flussometro, posto dopo la pompa, regolerà
la quantità di eluente che, nelle condizioni d’esercizio
scelte, sarà immesso nella colonna.
Prima della colonna cromatografica viene posto un
iniettore, che permette l’inserimento del campione sciolto in
un solvente opportuno. Per evitare di danneggiare la fase
stazionaria della colonna é opportuno eseguire una
prefiltrazione, attraverso una analoga colonna più piccola
posta in serie, contenente lo stesso tipo di fase stazionaria
con una dimensione delle particelle più grande, allo scopo
di eliminare le impurezze grossolane, le morchie e le
particelle insolubili contenute nel campione da analizzare.
Mauro Sabella
Alla fine della colonna cromatografia viene posto un adatto rivelatore che, attraverso il cromatogramma, darà indicazioni sull’andamento della separazione.
Nel caso in cui si opera in isocratica é sufficiente una sola pompa (figura 1), mentre nel caso in cui si opera a gradiente (figura 2), è necessario usare due pompe per mescolare i solventi ed inviarli alla colonna ad un valore controllato di pressione, le condizioni operative, in questo caso, verranno programmate in anticipo tramite un calcolatore che automaticamente effettuerà le operazioni necessarie. E’ importante osservare che, poiché l’HPLC opera con un alto flusso di fase mobile e quindi in condizioni di alta pressione, tutto il sistema operativo deve essere adatto per lavorare in queste condizioni.
Mauro Sabella
In particolare la fase stazionaria è posta in una colonnacromatografica fatta con un materiale adatto persopportare pressioni elevate (generalmente sonod’acciaio) e la colonna stessa deve essere inserita in unacamicia all’interno della quale sarà esercitata unapressione tale da equilibrare la pressione esercitata dallafase mobile all’interno della colonna.
Nel caso di una HPLC di tipo preparativo, il rivelatoredarà informazioni sulla separazione della miscela, perraccogliere le varie frazioni di eluito contenente lesostanze purificate. Nel caso in cui la separazione deivari costituenti risulterà parziale, le frazioni raccolte checontengono i componenti puri verranno raccolte, mentrele frazioni che contengono ancora le sostanze in miscelaverranno dirottate con un rubinetto ed inviate allacolonna per essere nuovamente cromatografate.
Mauro Sabella
Oltre ai vantaggi precedentemente elencati per questotipo di tecnica, l'HPLC costituisce un sistemacromatografico altamente efficiente in quanto:
- usa delle fasi stazionarie altamente perfezionate emolto versatili anche per separazioni particolarmentedifficili,
- usa rivelatori molto sensibili che vengono adattati altipo di sostanza da separare;
- usa un alto flusso delta fase stazionaria che porta aduna esecuzione molto rapida nel tempo ed efficace.
Mauro Sabella
UNITÀ DI PRESSIONE UTILIZZATE PER L’HPLC
Per questa tecnica cromatografia, l’unità di
pressione utilizzata è il pascal (pa)
1 pascal = 1 newton/m2 = 1x105 bar
1 bar = 0,9869 atm = 1,01 Kg/cm2
1 Megapascal (Mpa) = 10 bar = 9,869 atm =
10,1971 Kg/cm2
Mauro Sabella
FASE MOBILE
Nell’HPLC Ia fase mobile verrà scelta in funzione dellesostanze da separare e deve presentare alcune caratteristichepeculiari tali da non generare inconvenienti, fra queste:
deve presentare una bassa viscosità, in quanto questo permette dioperare, all'interno della colonna, in condizioni di pressione dieluizione non troppo elevata;
deve essere degasificato prima dell'introduzione in colonna; lapresenza di aria può modificare chimicamente le sostanze daseparare oppure dare alterazioni nella risposta del rivelatore
deve essere puro, perchè la presenza di sostanze estranee puòdanneggiare la colonna;
deve avere una temperatura di ebollizione sufficientemente elevataper evitare fenomeni di volatilizzazione alle temperature usatedurante l'operazione cromatografica.
Mauro Sabella
I SISTEMI DI POMPAGGIO
Le caratteristiche cui devono soddisfare le pompe impiegate per
l’HPLC sono molto restrittive e includono:
o Generazione di pressioni maggiori di 6000 psi (lb/in2)
o Non generare un pressione pulsatile in uscita
o Velocità di flusso variabili in un range di 0.1-10 ml/min
o La riproducibilità del flusso non deve variare più dello 0.5%
o Resistenza alla corrosione verso una grande varietà di solventi
Sono impiegati due tipi di pompe meccaniche: una del tipo a
siringa guidata a vite oppure una pompa alternativa (o a pistone),
mostrata in Figura 3.
La prima produce un flusso senza pulsazione e la velocità del
flusso è facilmente controllabile; ha però lo svantaggio di un alto
volume di riempimento, che diventa un problema quando devono
essere sostituiti i solventi.
Mauro Sabella
POMPE PER HPLCLe pompe a pistone sono quelle più
comunemente usate e sono costituite da
una piccola camera cilindrica che è
riempita e vuotata dal movimento di un
pistone. Il pompaggio produce un flusso
pulsatile che deve essere
successivamente linearizzato. I vantaggi
delle pompe a pistone sono un piccolo
volume interno, la capacità di generare
alte pressioni in uscita (superiori a
10000 psi), rapida adattabilità al
cambiamento dei gradienti nel corso
dell’analisi, flusso costante e inoltre sono
molto poco sensibili alla viscosità del
solvente e alla pressione in testa alla
colonna.
Mauro Sabella
Mauro Sabella
SISTEMA DI INIEZIONE DEL CAMPIONE
Sebbene nella cromatografia in fase liquida sia spesso usatal’iniezione tramite siringa attraverso un setto costituito di materialeelastomero, questa procedura non è molto riproducibile e si puòusare solo a pressioni di lavoro inferiori a 1500 psi.
Nella iniezione stop-flow il flusso del solvente viene bloccato perpermettere l’asportazione di una piccola quantità di solvente in testaalla colonna e il caricamento del campione, sempre in testa, tramiteuna siringa.
Comunque il metodo di caricamento più usato in HPLC è quelloche usa il sampling loop, come mostrato in Figura 4. Questidispositivi sono equipaggiati di loop intercambiabili di capacitàvariabile dai 5 ai 500 μl. La caratteristica principale delsistema di iniezione tramite loop è l’alta riproducibilità deivolumi iniettati. 3
Mauro Sabella
Sistemi di iniezione per HPLC.
Mauro Sabella
SELEZIONE DELLA TECNICA HPLCMauro Sabella
ELUIZIONE ISOCRATICA O IN GRADIENTE
isocratica isocratica gradiente
(più forte) (meno forte)
Mauro Sabella
COLONNE PER HPLC
Le colonne per HPLC sono di solito
costruite in acciaio, ma esistono
anche in vetro ricoperto di metallo
impiegate soprattutto quando si lavora
a pressioni inferiori a 600 psi. La
lunghezza delle colonne varia da 10 a
30 cm e il diametro interno da 4 a 10
mm. Le colonne sono generalmente
impaccate con particelle di diametro
variabile dai 5 ai 10 μm. Colonne di
questo tipo arrivano generalmente a
contenere dai 40000 ai 60000 piatti
per metro di lunghezza.
Mauro Sabella
Recentemente sono state introdotte sul mercato
microcolonne lunghe dai 3 ai 6.5 cm e aventi un
diametro interno variabile da 1 a 4.6 mm. Queste
colonne che sono impaccate con particelle di diametro
variabile dai 3 ai 5 μm, contengono più di 100000
piatti per metro e hanno il vantaggio di una maggiore
velocità operativa e di un minore consumo di solvente.
Quest’ultima proprietà è di notevole importanza
perché i solventi ad alta purezza richiesti per questo
tipo di cromatografia sono molto costosi. Con questo
tipo di colonne vi sono esempi di separazione di 8
composti in un tempo di 15 secondi con una colonna
lunga 4 cm con un diametro interno di 4 mm e
impaccata con particelle di 3 μm di diametro. 6
Mauro Sabella
Il più comune materiale usato per impaccare lecolonne per HPLC è la silice, preparata peragglomerazione di particelle di diametro inferioreal micron sotto condizioni che portano a particellepiù grandi con diametri altamente uniformi.
Le particelle risultanti sono spesso rivestite consottili film di composti organici, che sono legatialla superficie tramite legami chimici o fisici.
Altri materiali usati per impaccare le colonne sono le particelle di albumina, di polimeri microporosi e resine a scambio ionico.
Mauro Sabella
RIVELATORI PER HPLC
Bulk properties: si misura una caratteristica della fase mobile che indirettamente rivela gli analiti
Solute properties: si misura una caratteristica del soluto
Spettrofotometrico UV-visibile (UV-Vis)
UV-visibile con Diode-array (UV-DAD)
Spettrofotometrico IR
Fluorimetrico
Indice di rifrazione (RID)
Elettrochimico (ED)
Spettrometria di massa (MS)
Mauro Sabella
RIVELATORI
I tipi di rivelatori che possono essere utilizzati per l'HPLC
sono diversi,
l'uso di ciascuno in relazione alla natura delle sostanze che
debbono essere evidenziate. E' evidente che, qualunque sia il
rivelatore usato, la fase mobile non deve in alcun
modo interferire nella determinazione ed il rumore di fondo
dello strumento non deve essere superiore al segnale più
basso dovuto alle varie sostanze da analizzare.
I rivelatori più comunemente usati sono:
•spettrofotometrici, (IR, UV ecc.), concentrazione minima
rilevabile 10-8 - 10-9 g/ml;
•fluorimetrici, concentrazione minima rilevabile 10-10 - 10-11
g/ml;
•a indice di rifrazione, un rivelatore a bassa sensibiIità
•a ionizzazione di fiamma.
Mauro Sabella
RIVELATORE SPETTROFOTOMETRICO UV-VISIBILE
il rivelatore più diffuso (copre più del 70% dei metodi di rivelazione)
basato sull’assorbimento di luce nel range UV-visibile
sensibile a moltissime sostanze organiche ed inorganiche (es. 254 nm)
sensibilità tipica: 0.1 ppb
è un sistema non distruttivo
Mauro Sabella
GRUPPI CROMOFORI
Cromoforo Formula lmax (nm) e
aldeide -CHO 210 1.500
amino -NH2 195 2.800
azo -N=N- 285-400 3-25
bromuro -Br 208 300
carbossile -COOH 200-210 50-70
chetone -C=O 195 1.000
disolfuro -S-S- 194 5.500
estere -COOR 205 50
etere -O- 185 1.000
etilene -C=C- 190 6.000
fenile -C6H5 202, 255
naftile 220, 275
nitrato -ONO2 270 12
nitrito -ONO 220-230 1.000-2.000
nitrile -C=N 160 -
nitro -NO2 210 forte
SCELTA DELLA LUNGHEZZA D’ONDA
La l del rivelatore va scelta in base ad alcune considerazioni:
massimizzare sensibilità e specificità
il solvente della fase mobile può causare shifts in lmax (2-5 nm)
controllare l’assorbanza degli analiti nella fase mobile
i solventi per fase mobile hanno cutoff (valore di soglia) nell’UV
operando sotto la lcutoff può:
ridurre la sensibilità
introdurre rumore sulla linea di base
Mauro Sabella
RIVELATORE A INDICE DI RIFRAZIONE
basato sulla
misura
del’indice di
rifrazione
dell’eluato
(tipico rivelatore
bulk)
non adatto con
eluizione in
gradiente
• sensibilità tipica: 0. 1 ppm
• completamente aspecifico
• necessita di termostatazione accuratissima
• si usa per composti non attivi nel range UV-visibile (zuccheri)
• è un sistema non distruttivo
Mauro Sabella
HPLC DI ADSORBIMENTO
I principi su cui si basa la cromatografia di adsorbimento sono stati già trattati nella parte generale. Si può operare in fase normale o in fase inversa in funzione del materiale che si usa per la fase stazionaria. La fase stazionaria può essere caratterizzata, in relazione alla sua struttura fisica, in due categorie:
materiale poroso sia in superficie che all’interno contraddistinto in
microporous, se la dimensione vana fra 5-10 mm;
macroporous, se la dimensione varia fra 50-100 mm
materiale, di dimensione compresa fra 20-40 mm, compatto nella parte interna e con una pellicola porosa in superficie dello spessore compreso fra 1-2 mm, che viene definito pellicular.
I macroporous e i pellicular vengono generalmente utilizzati per cromatografie preparative.
I materiali più comunemente utilizzati sono: gel di silice, allumina, poliamidi, cellulosa, acetato di cellulosa, chromosorb(polimeri del vinil- e divinilbenzene).
Mauro Sabella
HPLC DL RIPARTIZIONE
Per questo tipo di cromatografia la fase stazionaria écostituita da un liquido che può essere legato ad unsupporto inerte fisicamente o chimicamente. Nel caso in cuila fase stazionaria è legata fisicamente, può verificarsi untrascinamento di essa da parte della fase mobile; per evitarequesto, che porterebbe ad una cromatografia nonperfettamente efficiente si usa saturare la fase mobile conla fase stazionaria.
In generale per evitare trascinamenti della fase stazionariasi usa operare legando chimicamente la fase stazionariainerte che in genere è costituita da gel di silice, in particolarevengono funzionalizzati in vario modo i gruppi silanolici(figura 3)
Mauro Sabella
Mauro Sabella
ALCUNI METODI DI FUNZIONALIZZAZIONE VENGONO RIPORTATI
NELLO SCHEMA SEGUENTE:
Mauro Sabella
Se si adopera come fase stazionaria silice legata
chimicamente con gruppi funzionali (bonded phase
chromatography) si può operare sia in fase normale che in
fase inversa in funzione della polarità dei gruppi legati al
supporto, si avrà così: fase normale: silice legata a gruppi
cianopropilici; fase inversa: silice legata a -C18, -C8, -fenile.
L’ordine di polarità dei vari gruppi legati alla silice varia
secondo la seguente scala di polarità: -CN > -NH2 > -C(CH3)2
> -C8> -fenile
Si può operare sia in fase normale che in fase inversa,
tenendo conto del tipo di fase mobile da usare in funzione del
tipo di fase stazionaria.
Mauro Sabella