Indicatori microbiologici e molecolari

Indicatori microbiologici

Dosaggio della carica microbica Rappresenta il numero di microrganismi, appartenenti ad un gruppo fisio-tassonomico generale (lieviti, funghi, batteri, actinobacteri, protozoi), oppure ad uno specifico gruppo fisiologico o funzionale (azotofissatori, proteolitici, ammonificanti, nitrificanti, denitrificanti, cellulosolitici, solfo-ossidanti, etc.), normalmente stimati in relazione al grammo di suolo.

Si può stimare la

dimensione (quantità), o la

composizione (qualità) della microflora tellurica.

Può essere determinata per via

diretta (osservazione al microscopio)

indiretta (colturale)

La carica microbica per via diretta

Si utilizzano dei coloranti per marcare cromaticamente le cellule microbiche da osservare successivamente al microscopio

Batteri

Batteri

Funghi

La carica microbica per via indiretta

La carica microbica viene determinata utilizzando terreni colturali agarizzati (in piastra) oppure liquidi, validi per gruppi generici di microrganismi, oppure “selettivi”

Schema generale di estrazione dal suolo e messa in coltura di cellule microbiche

Dopo incubazione delle piastre, le colonie formate vengono enumerate

Il 99% delle specie di batteri del suolo è sconosciuto (Ritz et al., 2003).

Il 95% dei batteri conosciuti (1%) non è coltivabile (Lynch, 2003).

Tuttavia…

Metodi di analisi molecolare

Permettono lo studio delle comunità microbiche del suolo in relazione alla loro composizione, struttura, dinamica e funzione

Analisi di steroli e di fosfolipidi di membrana (FAME, PLFA)

Analisi di acidi nucleici (DNA e RNA)

Acidi grassi di fosfolipidi (PLFA)

Dosaggio dell’ATP

Dosaggio del DNA

per g soil: µg BC = 5.8·nmol total PLFA

per g soil: µg BC = 6.0·µg DNA

Metodi di indagine molecolare

Il 16S rDNA rappresenta la molecola di elezione per l’analisi della diversità batterica ed è attualmente la biomolecola più utilizzata nelle indagini di caratterizzazione biomolecolare per lo studio delle comunità batteriche del suolo

Variabili misurate

- Proprietà fisiche Sabbia, limo, argilla

- Proprietà chimiche TOC,TN, pH, CEC, EC, TCa, ACa

- Proprietà biochimiche Cmic, Nmic, Extr-C, Extr-N, SBR, qCO2

- Attività enzimatiche fosfatasi acida (AcP), fosfatasi alcalina (AlkP), arilsolfatasi (ArS), deidrogenasi (DH), -glucosidasi (Glu), FDA-idrolasi (FDA)

- Struttura molecolare via PCR-DGGE

Variabili indagate: 22 Profili campionati: 11 (x 3 replicati)

16S rD

NA

Soil bacterial community analysis

Direct soil DNA extraction and purification

PCR with bacterial primers targeting the V6-V8 hypervariable regions

Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis of PCR-amplified 16S rDNA fragments.

Fragments with the same length but different base composition are separated along a denaturing chemical (Urea + Formamide) gradient.

40% UF

58% UF

1-Ap 1-Bw 1-Bk 2-Oa 2-A 2-AB N

DGGE bacterial community fingerprinting

BS 3-Ap 3-Bw 4-A 4-Bw 4-BC N

DGGE bacterial community fingerprinting

Dendrogramma di similarità

Cluster 1

Cluster 2

Cluster 3

Cluster 4

Cluster 5

Cluster 6

I processi di pedogenesi determinano l'evoluzione del suolo con la formazione di orizzonti diversi - caratterizzati da distinte proprietà chimico-fisiche - che ospitano diversificate comunità microbiche funzionalmente attive, le quali, a loro volta, sostengono il processo pedogenetico dell’orizzonte e ne determinano l’evoluzione