Jessica Caprioli - Mario Negri · Che cosʼè la genetica • Eʼ la scienza che studia i geni e in...

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Jessica Caprioli Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri Centro di ricerche cliniche per le Malattie Rare

Aldo e Cele Daccò, Ranica

Dipartimento di Medicina Molecolare

Genetica: metodi di studio e

applicazioni in medicina

Come è organizzata questa lezione

•  Introduzione

•  Diapositive teoriche: sfondo blu •  Diapositive relative ad un esempio

reale: sfondo azzurro

Che cosʼè la genetica •  Eʼ la scienza che studia i geni e in

particolare la loro: •  Struttura •  Funzione •  Trasmissione

Si occupa inoltre di identificare le alterazioni dei geni che producono malattie e come queste alterazioni vengono trasmesse.

Gregor Mendel (1822-1884) pubblica il suo lavoro “Experiments in Plant Hybridisation” e stabilisce le leggi dellʼereditarietà.

- dominanza (F1 omogenea per un dato carattere)

-  segregazione dei caratteri (incrociando individui della F1 in carattere recessivo ricompare nella F2)

-  assortimento independente dei caratteri (segue la trasmissione di due caratteri diversi nelle generazioni)

Archibald E. Garrod (1857-1936) postula che i difetti genetici causano molte malattie ereditarie.

A causa di un difetto genetico, i pazienti con alcaptonuria sono privi di un enzima del metabolismo. Il risultato di tale deficit è un accumulo di un composto chimico che rende scure le urine.

James Watson e Francis Crick scoprono la struttura tridimensionale del DNA e subito dopo ne deducono il meccanismo di replicazione.

LA STRUTTURA DEL DNA •  Lineare, a doppia elica: due

catene attorcigliate, orientate in senso opposto lʼuna rispetto allʼaltra

•  Struttura portante di ciascuna catena è composta da un polimero costante: zucchero-fosfato-zucchero-fosfato

•  Ad ogni zucchero (desossiribosio) si lega una base o nucleotide

•  4 basi: Adenina (A) Citosina (C) Guanina (G) Timina (T)

Ogni uomo è formato da 100 miliardi di cellule

Ogni cellula contiene nel proprio nucleo 46 cromosomi: 23 di origine paterna e 23 di origine materna

Ogni cromosoma è un piccolo bastoncello formato da una lunga molecola attorcigliata su se stessa, il DNA

Il codice genetico è il manuale di istruzioni per il corretto funzionamento della cellula

…..AGCTAACTGGTACTAGTCAGGTACTCCTAGCA…..

15 February 2001

Il genoma è organizzato in 46 cromosomi (capitoli del codice) e i geni sono contenuti nei cromosomi. Ciascun cromosoma è lungo circa 50 mm e quindi in ogni cellula sono contenuti circa 2 m di DNA.

16February 2001

CHE COSA SONO I GENI

I geni sono le istruzioni necessarie alla cellula per compiere tutte le sue funzioni vitali

…..AGCTAACTGGTACTAGTCAGGTACTCCTAGCA…..

Il codice genetico è il manuale di istruzioni per il corretto funzionamento della cellula

La funzione principale di ogni gene è la formazione di proteine

Funzioni di una proteina: - strutturale - enzimatica -  di controllo

Transcription

Transcribed strain

Nucleus

Cytoplasm

Growing polypeptide

Anticodon

Codon Translation

Dal gene alla proteina

GENI PROTEINE

Gene alterato Proteine alterate

Predisposizione alla malattia

Malattia

Le mutazioni

Come si possono identificare le mutazioni?

La malattia ha una componente genetica? 1) Studio delle famiglie 2) Identificazione dellʼarea genomica di interesse

Individuazione del gene mutato 3) Studio del DNA e identificazione della mutazione 4) Verifica dellʼeffetto funzionale della mutazione

A compiere una diagnosi corretta

A identificare i soggetti a rischio (medicina preventiva)

A cosa serve identificare le mutazioni?

sono causate da un singolo gene

1) Studio delle famiglie

LA SINDROME EMOLITICO-UREMICA

Malattia multisistemica caratterizzata da anemia emolitica e trombocitopenia, con predominante, ma non esclusivo, coinvolgimento renale.

Ripercorriamo con un esempio quanto visto finora

= affected = probably affected = unaffected to date

= spontaneous abortion

male female = dead

- Quali sono le caratteristiche della patologia?

- Eʼ possibile supporre che alcune proteine e quindi alcuni geni possano essere coinvolti? In altre parole, abbiamo uno o più geni candidati?

I MARCATORI POLIMORFICI

PRIMER PRIMER RIPETIZIONI CA

24 ripetizioni 23 ripetizioni 22 ripetizioni 21 ripetizioni

b a c d individui I MICROSATELLITI

2) Identificazione dellʼarea genomica di interesse: lʼanalisi di linkage

La PCR

Denaturazione a 94°

Annealing dei primers

Ripetendo questo procedimento per 20-35 volte si ottengono più di 2.000.000 di copie del frammento di DNA di interesse che può essere visualizzato facilmente e utilizzato per il sequenziamento.

2) Identificazione dellʼarea genomica di interesse: lʼanalisi di linkage

I due soggetti affetti ereditano dal padre lo stesso tratto cromosomico nellʼintorno del gene di interesse: è probabile quindi che questo sia il gene responsabile della malattia in questa famiglia.

D1S412 D1S2816 D1S413 D1S2738

3 5 2 3 2 7 2 2

7 1 3 2 7 6 2 3

5 1 3 2 7 6 2 3

F M F M F M

3 7 2 3 2 7 2 2 F M

Chromosome 1

Gene di interesse

- A volte non è possibile individuare alcun gene candidato.

- In questi casi è possibile estendere lʼanalisi di linkage a tutto il genoma, fino ad individuare la regione candidata. Allʼinterno di tale regione si cercherà poi il gene responsabile della malattia.

Individuazione del gene mutato 3) Studio del gene e identificazione della mutazione 4) Verifica dellʼeffetto funzionale della mutazione

Il sequenziamento

TCT TTC ATC ATG TTC TCC

TCT TTC ATC ACG TTC TCC

Ser Phe Ile Met Phe Ser

Ser Phe Ile Thr Phe Ser

Normale

Mutato

Normale G A C A C A A T T G T C T G T Asp Thr Ile Val Cys Mutato A A T T G T C T G T G A Asn Cys Leu Stop

Caso clinico

Paziente di 21 anni in emodialisi in seguito a ripetuti episodi di SEU Fratello con storia di SEU Genitori sani

Analisi genetiche

COME CAMBIERAʼ LA MEDICINA?

Individuazione del genotipo

Terapia mirata

Comprensione del difetto biologico

Fattore H

C3b MCP Fattore B

Il sistema del complemento non si attiva Le cellule dell’organismo sono protette

C3b Fattore B

Il sistema del complemento si attiva Cellula batterica

Cellula umana nucleo

Fattore H

Prodotto principalmente dalle cellule del fegato

Fattore H

Terapia mirata: il trapianto di rene non funziona, ma è possibile ad esempio infondere la proteina normale (come

lʼinsulina nel caso dei diabetici)

C3b C3b inattivato

+ Fattore I

ell’i

10 15 20 25 30 35 40 45 50

Controlli dializzati

Controlli sani

Madre Soggetti con mutazione

(33.1-39.6) (45.3-46.5)

MCP normale

MCP alterato

E’ possibile che la disfunzione in MCP, che e’ una proteina di membrana

altamente espressa nel rene, possa essere corretta trapiantando un rene

normale?

CASO CLINICO: B.A. una giovane donna con SEU Agosto 1994, a 25 anni:

Diagnosi: SEU

Progressivo deterioramento della funzione renale Severa, intrattabile ipertensione Nefrectomia bilaterale:

Remissione completa dei processi microangiopatici Pressione sanguigna normalizzata, emodialisi

Riceve un trapianto di rene Nessun segno di ricorrenza, fino ad oggi buona funzione renale

Nessuna mutazione al Fattore H Mutazione nel gene di MCP

Gennaio 1995:

Giugno 1995:

Ottobre 2003: analisi genetiche

Terapia mirata

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