PPolymerase olymerase CChain hain RReactioneaction

LA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI e LE SUE

APPLICAZIONI

Prima diagnosi molecolare sul DNA

*Primo ormone umano ricombinante (insulina)*Premio Nobel agli scopritori degli enzimi di restrizione*Identificato l’AIDS*Prodotto il depakene (epilessia)*Prima bambina in provetta (Luise)*Appare sul mercato l’Apple Computer ed i floppy disk

1978

Com’era l’analisi genetica Com’era l’analisi genetica prima della PCR?prima della PCR?

� Il Southern blotting (1975) permetteva un’analisi approssimativa dei geni (RFLPs, inserzioni & delezioni)

� Il sequenziamento del DNA (1978) richiedeva che I geni venissero prima clonati in appositi vettori (plasmidi o fago l)

� La costruzione di genoteche e lo screening potevano richiedere molti mesi e le genoteche dovevano essere preparate per ciascun individuo analizzato

L’invenzione della PCRL’invenzione della PCR

� Ideata da Kary Mullis nel 1983

� La prima pubblicazione è apparsa nel 1985

� Premio Nobel per la chimica nel 1995

Descritta la reazione di PCR

1985Parte il progetto genoma umano

La PCR La PCR rappresentarappresenta la la secondaseconda rivoluzionerivoluzione

nellenelle tecnichetecniche didi manipolazionemanipolazione del DNAdel DNA

E’ E’ essenzialmenteessenzialmente unauna tecnicatecnica didi

amplificazioneamplificazione del DNAdel DNA

LA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI

Mullis & Faloona 1988

È possibile generare grandi quantità di DNA target anche se il numero di partenza delle sue copie è molto basso

Attualmente è possibile analizzare praticamente ogni tipo di campione, anche nel caso in cui contenga DNA degradato

La PCR è un procedimento mediante il quale è possibile ottenere molte copie di una determinata regione del DNA (sia nucleare chemitocondriale)

È necessario conoscere la sequenza delle regioni che fiancheggiano il tratto di DNA che si vuole studiare, per disegnare i PRIMERS (tratti di DNA di circa 20-30 nucleotidi complementari alle regioni fiancheggianti, senza i quali non è possibile effettuare una PCR)

Cos’è la PCRCos’è la PCRE’ la sintesi progressiva ed esponenziale di un

definito segmento di DNA targhet in vitro.Più semplicemente da pochi frammenti targhet

di partenza ne ottengo una grande quantità.

Cos’èCos’è la PCR? : la PCR? :

E’ chiamata “Polymerase” perchè l’unicoenzima utilizzato nella reazione è la DNA polimerasi.

E’ chiamata “Chain” a catena perchè ilprodotto della prima reazione diventa ilsubstrato per la seguente e così via.

Cos’èCos’è la PCR? : la PCR? : componenticomponenti

1) Stampo DNA (Target) – contiene la sequenza daamplificare.

2) Coppia di Primers – due oligonucleotidi disegnati sullasequenza da amplificare. Segmenti complementari a due regioni che si trovano su filamenti opposti del dna stampo ai lati della regione targhet.

3) dNTPs – desossinucleotidi trifosfati: I 4 mattoni checostituiscono il DNA.

4) DNA Polimerasi termostabile – enzima che catalizza la reazione (non viene denaturata se portata a 95° c)5) Ioni Mg++ - cofattori dell’enzima

6) Soluzione Buffer – mantiene le condizioni ideali per l’ativitàenzimatica in particolare il pH e la concentrazione ionica.

� Synthesis by DNA polymerase

-A T G C A T G C A T G C * *

T A C G T AA C G-T5’ 3’

Uno Uno specificospecifico DNA a DNA a singolasingola elicaelica (primer o (primer o innescoinnesco) ) ibridaibrida con con l’elical’elica cheche devedeve essereesserecopiatacopiata

Taq polimerasi

DNA

Nucleotidi 4 Primer F+RddH20

BufferMg++

1- DENATURAZIONE (DENATURATION): TEMP. 95°C. IL DNA STAMPO VIENE DENATURATO, I DUE FILAMENTI SI SEPARANO

2-APPAIAMENTO (ANNEALING) : TEMP. 50-60°C CIRCA. I PRIMERS SI APPAIANO CON IL DNA STAMPO

3- SINTESI (EXTENSION): TEMP. 72°C E’ OTTIMALE PER IL FUNZIONAMENTO DELLA Taq (Termus aquaticus) POLIMERASI

IL PROCESSO DI PCR PREVEDE UN IL PROCESSO DI PCR PREVEDE UN

CERTO NUMERO DI CICLI. CERTO NUMERO DI CICLI.

Ogni ciclo consiste di 3 passaggi condotti ad una specifica Ogni ciclo consiste di 3 passaggi condotti ad una specifica

temperatura:temperatura:

ThermociclatroreThermociclatrore, ,

AppliedBiosystemsAppliedBiosystems

TuboTubo dadaPCRPCR

Come funziona la PCRCome funziona la PCR

� Come fa la polimerasi a sapere quando fermarsi una volta che ha raggiunto l’altro primer?

� PCR animation

Quanto è potente la PCR?Quanto è potente la PCR?

� La PCR può amplificare fino ad ottenere una quantità utilizzabile di DNA (visibile su gel) in meno di 2 ore

� Lo stampo di DNA non necessita di particolarepurificazione se il frammento da amplificare è di dimensioni ridotte (fino a 1000bp)

� Il prodotto della PCR può essere digerito con enzimi di restrizione, sequenziato o clonato

� La PCR può amplificare una singola molecola di DNA (es. uno spermatozoo)

Quante copie?Quante copie?

� Nessun prodotto fino al 3° ciclo

� L’accumulazione non è un raddoppiamento completo dopo ciascun ciclo

� Dopo 32 cicli ci dovrebbero essere max 1,073,741,764 copie di lunghezza

definita (~1×109)

PROBLEMI

POSSIBILITA’ DI CONTAMINAZIONEFRA CAMPIONI

POSSIBILI SOLUZIONI:- utilizzo di particolari procedure e precauzioni

AMPLIFICAZIONE DI ZONE NON SPECIFICHE: i primers si legano anche a sequenze lontane dal DNA stampo.

POSSIBILI SOLUZIONI:- variazione della concentrazione di MgCl2;- variazione della temperatura di annealing

AMPLIFICAZIONE PREFERENZIALE DI UN ALLELE (drop out) IN UN ETEROZIGOTE

POSSIBILI SOLUZIONI:- ripetizione della reazione di amplificazione

?

?

?

?

PCR PCR problematicheproblematiche

� Contaminazioni– In fase di campionamento– Durante il trasporto– In laboratorio in fase d’analisi da altri

campioni� Il controllo negativo è utilizzato per

identificarle� I Primers non sono abbastanza specifici

– Fare ulteriori prove– Ottimizzare le condizioni

PCRPCRVANTAGGI:� Sensibilita’

� Rapidita’

� Si presta all’analisi simultanea di molti campioni (high throughput)

� Si presta all’analisi simultanea di diverse sequenze sullo stessocampione

� Si presta all’analisi di DNA degradato o incluso in mezzi strani

SVANTAGGI:� Sensibilita’ (rischio di contaminazioni-falsi positivi)

� Variabile efficienza di amplificazione a seconda della sequenza

� Richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificare e messaa punto per coppie di oligonucleotidi di innesco (primers)

� Può sintetizzare frammenti relativamente corti

� La sintesi è imprecisa e introduce errori nella sequenza (la Taq polnon possiede attività 3’->5’ esonucleasica)

EsempiEsempi di di utilizzoutilizzo delladella PCRPCR� Su DNA:

– segnalare la presenza o meno di sequenze specifiche(mutazioni, inserzioni) -> DIAGNOSTICA

– Amplificare frammenti specifici da usare in seguitocome sonde oppure da “clonare”

� Su RNA messaggero (RT-PCR):– segnalare la presenza di specifiche molecole di RNA

(espressione genica)

– Amplificare frammenti specifici da usare in seguito

come sonde oppure da “clonare” - isolare cDNA

specifici per determinati geni.

Grazie alla presenza dei gruppi fosfato

(PO43-) il DNA è carico

negativamente e migrerà quindi verso il

polo positivo

Come Come verificareverificare se la PCRse la PCR

ha ha funzionatofunzionato??

ElettroforesiElettroforesi susu gel: gel: visualizzazionevisualizzazione direttadiretta delledelle molecolemolecoleseparazioneseparazione orizzontaleorizzontale ----> > AgarosioAgarosio = DNA ed RNA= DNA ed RNA

Il DNA Il DNA coloratocolorato con con bromurobromuro didi etidioetidioemetteemette unauna fluorescenzafluorescenza didi colorecolore rossorosso--arancioarancio se se sottopostosottoposto a a luceluce UVUV

VERIFICA SU GEL DI AGAROSIO

DNA

2000

1500

1000

500

200

LA PCR HA DATO

IL RISULTATO

SPERATO:

E’ stata amplificata

solo la sequenza target

LA PCR NON E’ VENUTA

BENE, BISOGNA

METTERLA A PUNTO:

Oltre alla sequenza target

sono stati amplificati anche

altri frammenti (aspecifici)

2000

1500

1000

500

200

� Marcatore genetico è una qualsiasi

caratteristica degli organismi che è’

variabile nelle popolazioni e che è

ereditabile, cioè determinata dai geni e non

dall'ambiente (Es: colore degli occhi,

gruppo sanguigno, bande su un gel).

I marcatori molecolariI marcatori molecolari

Caratteristiche ideali di un marcatore genetico:Caratteristiche ideali di un marcatore genetico:

� Polimorfico

� Avere un'espressione stabile (non influenzata dall'ambiente, da altri geni, ecc.)

� Disperso nel genoma

� Di facile determinazione o facile osservazione (basso costo in termini di denaro, tempo ed energie)

� Ereditabile in modo semplice (mendeliano o uniparentale)

� Codominante

� Riproducibile entro e fra diversi laboratori

� Determinabile con metodologia applicabile a molte specie diverse

Il SEQUENZIAMENTO del DNA MITOCONDRIALE (mtDNA)

Svantaggi. Si ottengono informazioni solo sulla linea materna, è

possibile amplificare copie nucleari che portano a risultati errati

Vantaggi. Metodo veloce, preciso, relativamente economico, necessita

di piccole quantità di DNA, solitamente il DNA target è conosciuto (già

depositato nella banca dati genetica) e mediamente polimorfico

Ereditarietà

Ibridazione

Riconoscimento dei singoli individui

Parentele

Variabilità

Uniparentale (per via materna)

Parziale NO

NO

Bassa-Alta

Caratteristiche

Tassonomia Sì

Quantità Elevato numero di copie per cellula

Utilizzo

Filogenesi Sì

MICROSATELLITI (Short Tandem Repeats)Tautz 1989

Svantaggi. L’isolamento di microsatelliti specie specifici può richiedere

un lavoro di laboratorio di molti mesi, primers cross-specifici spesso non

sono disponibili. Sono necessarie le frequenze alleliche delle popolazioni di

riferimento per utilizzare test statistici di assegnamento individuale

Vantaggi. Metodo veloce, preciso, relativamente economico, necessita

di piccole quantità di DNA, il DNA target è altamente polimorfico

Caratteristiche

Variabilità Alta

Utilizzo

Ereditarietà

Quantità

Biparentale (per via materna e paterna)

Due sole copie per cellula

Ibridazione Riconoscimento dei singoli individui

Parentele

Sì

Sì

Sì

Tassonomia Sì

Gli SNPs(Single Nucleotide Polymorphisms)

Svantaggi. Possono essere sottoposti a selezione, se si trovano in

regioni codificanti del DNA, nel qual caso hanno un’evoluzione molto lenta

Vantaggi. Metodo molto veloce, preciso, relativamente economico,

necessita di piccole quantità di DNA, può studiare gli adattamenti delle

specie nei confronti dell’ambiente

Ereditarietà

Ibridazione

Riconoscimento dei singoli individui

Parentele

Variabilità

Uniparentale o Biparentale

Sì Parziale

Parziale

Bassa-Alta

Caratteristiche

Tassonomia Sì

Quantità Dipende se mitocondriali o nucleari

Utilizzo

Filogenesi Sì

GRAZIE PER GRAZIE PER

L’ATTENZIONEL’ATTENZIONE

E’ E’ tuttotutto chiarochiaro ??????

AlcuniAlcuni materialimateriali integrativiintegrativi

Schema della PCRSchema della PCR

DNA

RNA

DNA

EstrazioneEstrazione deldelDNA o DNA o

RNA RNA daldal campionecampione

Rivelazione

Amplificazione

Reverse transcription

COMPONENTE VOLUME Concentrazionefinale

10 X PCR Buffer 5µµµµl 1X1X

10 X dNTPs (2mM) 55µµµµµµµµll 200200µµMM

Forward primer (5 pmols/µµµµl) 55µµµµµµµµll 0.50.5µµMM

Reverse primer (5 pmols/µµµµl) 55µµµµµµµµll 0.50.5µµM M (25pmols/50(25pmols/50µµl)l)

DNA genomico stampo 22µµµµµµµµll 11µµgg

polimerasi termostabile(5U/µµµµl)

0.20.2µµµµµµµµll 1 1 unitunitàà

H2O (a 50µµµµl di volume finale) 27.827.8µµµµµµµµll

TIPICA MISCELA DI REAZIONE

25 o 5025 o 50µµµµµµµµl in l in unauna provettaprovetta micro micro EppendorfEppendorf (0.2 o 0.5 ml)(0.2 o 0.5 ml)

How Big A Target?How Big A Target?

� Amplification products are typically in the

size range 100-1500 bp.

� Longer targets are amplifiable — >25 kb.

� Requires modified reaction buffer, cocktails

of polymerases, and longer extension times.

� Limited by the integrity of the starting

target DNA — > 50 kb.

Designing PCR PrimersDesigning PCR Primers

� Primers should be ~20 bases long.

� The G/C content should be 45–55%.

� The annealing temperatures should be within

1°C of one another.

� The 3´-most base should be a G or C.

� The primers must not base pair with each

other or with themselves or form hairpins.

� Primers must avoid repetitive DNA regions.

Optimising the PCR ReactionOptimising the PCR Reaction

� Annealing temperature of the primers.

� The concentration of Mg2+ in the reaction.

� The extension time.

� (The denaturing and annealing times.)

� (The extension temperature.)

� (The amount of template and polymerase

— “more is less”.)

Automated DNA sequencing