Post on 04-Aug-2019
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La valutazione del microbiota
in ambito veterinario
Bianca Castiglioni, IBBA-CNR
CORSO
“Approcci immunologici attuali a problematiche di sanità e benessere animale”
Istituto Superiore di Sanità
Roma, 17 Maggio 2019
Cosa è il Microbiota?
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
Microbiota: una comunità microbica
composta da più microrganismi
simbiotici, commensali e persino patogeni
Microbioma: i genomi e/o i geni dei
microrganismi che costituiscono una
comunità microbica
Cosa è la metagenomica?
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
La metagenomica è lo studio del DNA genomico
ottenuto da microrganismi che non possono essere
coltivati in laboratorio
L'analisi metagenomica è ...
una tecnica indipendente dalla
cultura
mirata al DNA batterico
basata su una tecnologia di
sequenziamento del DNA ad alto
rendimento
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
Genomica versus Metagenomica
16S metabarcoding
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
E’ una tecnica di analisi
metagenomica basata
sulla combinazione di
amplificazione PCR e
sequenziamento di una
porzione del gene che
codifica per 16S rRNA
16S metabarcoding
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
L’rRNA 16S è ampiamente utilizzato come marcatore filogenetico nella
classificazione e identificazione di Batteri e Archaea
A livello della sequenza del 16S si possono individuare delle regioni conservate uguali nella totalità dei
batteri, delle regioni semiconservate che sono identiche - o molto simili - a livello di phylum., delle
regioni variabili, molto differenti tra batteri dello stesso genere
Profilo tassonomico a livello di phylum
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
Richness and diversity metrics
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
La ricchezza è bassa in A e B, con solo quattro OTU presenti. La ricchezza è
maggiore in C e D, con 10 OTU presenti.
La diversità, che rappresenta l'uniformità e il numero di OTU, è maggiore in
B che in A, e maggiore in D che in B.
Richness and diversity
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
Il punto importante da ricordare quando si parla di ricchezza e
diversità è che una maggiore ricchezza e diversità sono
generalmente associate a una salute migliore in sistemi dove il
microbiota è stato ben caratterizzato, come l'intestino o la pelle
Cho et al., Nat Rev Genet 2012;13(4):260–70
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
Microbiota
È ormai noto che tutti i mammiferi ospitano
comunità microbiche ampiamente
diversificate
Gli uomini, ad esempio, sulla loro
pelle, intestino, tratti genitali,
urinari e oro-faringei ospitano
un'ampia varietà di comunità
microbiche che, attraverso
intricate interazioni
mutualistiche, si sono evolute
con loro e svolgono ruoli
cruciali nella loro biologia e
salute
Il microbiota degli animali da allevamento
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
Anche gli animali da allevamento ospitano un'ampia varietà di comunità
microbiche che si sono evolute con loro mediante interazioni complesse e
mutualistiche, che svolgono ruoli cruciali nella loro biologia e salute
Microbiota bovino
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
I bovini ospitano un'ampia varietà di
comunità microbiche su:
pelle
rumine
intestino
tratti genitali e urinari
orofaringe
mammella
Microbiota del latte
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
Data la sua importanza per la salute degli animali e le correlazioni con la
qualità e la sicurezza delle produzioni lattiero-casearie, l'interesse per la
comprensione dell'origine e della composizione del microbiota del latte è
cresciuto significativamente negli ultimi anni
Microbiota del latte
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
Per molto tempo si è ritenuto che la
ghiandola mammaria e il latte in
essa contenuti fossero sterili, e si
pensava che i microrganismi presenti nel
latte fossero il risultato di una
contaminazione esterna
Addis et al., 2016
Più recentemente diversi studi
hanno invece supportato l'ipotesi
che i batteri sono presenti nel
latte non solo come risultato di
una colonizzazione esterna
Microbiota del latte
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
Lo sviluppo delle cosiddette tecnologie "omiche" di
sequenziamento e i progressi nelle tecniche colturali hanno
rafforzato la consapevolezza che il latte ospita una comunità
microbica diversificata e complessa
Potenziali origini del microbiota intramammario
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
Nel lavoro di Young et al. (2015) è
stato descritto il trasferimento di
batteri intestinali alla ghiandola
mammaria bovina, supportando cosi
l'esistenza di un “pathway entero-
mammario” endogeno anche nei
ruminanti
I risultati di questo studio
supportano l'insorgenza di un
meccanismo responsabile della
migrazione di alcuni componenti del
microbiota intestinale alla ghiandola
mammaria attraverso la circolazione
dei globuli bianchi
Tuttavia, resta da stabilire quali siano
i tipi di cellule responsabili del
traffico di microbiota dai linfonodi
mesenterici al latte
Entero-mammary pathway in ruminants
Addis et al., 2016
Potenziali origini del microbiota intramammario
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
Anche se l'origine del
DNA batterico nel
latte è ancora
sconosciuta, si sa che
la sua
composizione può
essere influenzata
da diverse fonti,
come la lettiera,
l'allattamento, la
mungitrice e la pelle
dei mungitori
Microbiota del latte
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
Nel lavoro di Zhang et al. (2015), gli autori hanno descritto differenze nelle
comunità microbiche del latte associate alla dieta
Influence of feeding on milk microbiota of dairy cows at species level
(LC, low-concentrate diet; HC, high-concentrate diet).
Microbiota del latte
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
The major phyla and genera in 12 months and
the significant differences between major
genera among 12 month:
Firmicutes, Proteobacteria and Actinobacteria
were the most abundant phyla and exhibited
a counter-balanced relationship.
the highest diversity of bacterial
composition was detected in June, while
the lowest was in December.
The abundances of Propionibacterium and
Pseudoalteromonas were negatively
correlated to total bacterial count, which
meant that they helped to maintain milk
quality.
Variazione del microbiota del latte nel corso di 12 mesi e impatto
delle condizioni meteorologiche
Li et al., Scientific Reports, 2018
Milk microbiome diversity and bacterial group prevalence in a
comparison between healthy Holstein Friesian and Rendena cows
(Cremonesi et al., PLOS One, 2018)
In questo studio, è stato confrontato il microbiota di latte di vacche HF e REN,
allevate nella stessa stalla e nelle medesime condizioni, durante il periodo di
transizione (tre settimane prima e tre settimane dopo il parto), allo scopo di
definire i gruppi batterici prevalenti con un possibile effetto sulla salute della
ghiandola mammaria
La Frisona Italiana (HF) è una razza da latte altamente
produttiva, mentre la Rendena (REN) è una razza
autoctona a duplice attitudine
Nel precedente lavoro di Curone et al.
(2017) era stato descritto come animali di
razza Rendena mostrino una maggiore
resistenza alla malattia rispetto ad animali di
razza Frisona allevati nelle stesse condizioni
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
I profili tassonomici di entrambe le razze sono dominati dai Firmicutes, per
lo più rappresentati dal genere Streptococcus, sebbene in proporzioni molto
diverse ( HF 27,5%, REN 68,6% )
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
La specie principale del genere
Streptococcus è rappresentato da
Str. thermophilus, un batterio
lattico (LAB). In particolare nella
razza Rendena rappresenta
oltre il 95% del totale degli
streptococchi presenti
Infine, solo il latte HF ha
mostrato cambiamenti
significativi nella composizione
microbica durante il periodo di
transizione, mentre REN ha
mantenuto un microbiota più
stabile
Queste differenze nel microbioma del latte potrebbero
avere un impatto sulla salute della ghiandola mammaria
Profonde differenze fra le
due razze sono emerse
anche dall'analisi
predittiva metabolica
dai dati del microbioma
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
Il microbioma mammario (Oikonomou et al., 2014) nelle vacche
da latte è differente tra sani e malati, ma non è chiaro
esattamente come i cambiamenti nel microbioma siano
correlati allo stato di malattia
Microbiota mammario
Lo sviluppo di sistemi per il
monitoraggio routinario
del microbioma mammario
dei bovini e la conseguente
possibilità di manipolarlo
possono diventare un aspetto
chiave della gestione della
mandria
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
Il microbiota del latte sano
In generale, i
profili tassonomici
dei campioni di
latte sano a livello
di phylum sono
dominati da:
Firmicutes
Proteobacteria
Bacteroidetes
Actinobacteria
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Kuehn et al., 2013; Oikonomou et al., 2014; Zhang et al., 2015; Falentin et al., 2016; Derakhshani et al., 2018
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
Il microbiota del latte sano
Composizione del
microbiota in
varie nicchie della
mammella
Derakhshani et al., J. Dairy Sci.2018
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Il microbiota del latte sano
NAS: non-aureus staphylococci
Some NAS species are detrimental to udder
health (resulting in clinical or subclinical
mastitis)
Some NAS species confer protection against
IMI (production of a wide range of
bacteriocins capaple to inhibit the growth of
major mastitis pathogens)
Corynebacterium spp also have
contradictory functionalities with regard to
conferring protection against IMI with major
pathogens
The Milk Microbiota of Healthy and Inflamed Bovine
Mammary Glands From Dryoff Through 150 Days in Milk
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
DR: dryoff
C1:4–7 DIM
C2: 11-14 DIM
Front. Vet. Sci. (2018) 5:247
Healthy: culture-negative milk with
SCC < 100,000 cells/mL at DR, C1,
and C2
CHRON: culture-negative milk
samples with SCC ≥ 150,000
cells/mL at DR and C1
NEWINF: new culture-negative
inflammation with variable DR milk
sample results and culture-negative
milk samples with SCC ≥ 150,000
cells/mL at C1 and C2
POS: bacterial growth in culture
and SCC ≥ 150,000 cells/mL at DR,
C1, and C2
Insights Into the Bovine Milk Microbiota in Dairy
Farms With Different Incidence Rates of
Subclinical Mastitis
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
Lo studio suggerisce che la variazione dei tassi di incidenza delle mastiti
subcliniche non è solo determinata dall'eterogeneità e dalla prevalenza dei
patogeni che causano la mastite, ma è anche associata alla presenza di batteri con
potenziali effetti benefici
Front. Microbiol. (2018) 9:2379
Lo sviluppo di mastiti cliniche e le risposte infiammatorie nella mammella
sono associati a:
diminuzione della diversità del microbiota commensale
interruzione dell'equilibrio ottimale tra la percentuale di gruppi
batterici benefici e quella dei batteri opportunisti e patogeni
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
Il microbiota del latte sano e del latte mastitico
Utilizzare la metagenomica per identificare i
membri influenti del microbiota della ghiandola
mammaria con ruoli centrali nel:
mantenere la salute della mammella
modulare la suscettibilità alla mastite
potrebbe essere un approccio innovativo per
l'isolamento mirato e la caratterizzazione di quelle
specie benefiche presenti nella comunità
microbica nativa della mammella
Salute della mammella e suscettibilità alla mastite
La diversità ottimale del microbiota intramammario, composta da un sano equilibrio tra gruppi batterici commensali e opportunistici, è essenziale per mantenere un equilibrio tra le risposte pro e anti-infiammatorie, e quindi mantenere l'omeostasi mammaria
Il microbiota commensale della mammella può modulare la suscettibilità all'IMI da parte dei patogeni della mastite attraverso: 1) il cross-talk diretto tra microorganismi, 2) la stimolazione indiretta dell'immunità o 3) entrambi
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
I batteri commensali possono resistere alla colonizzazione di agenti patogeni esogeni
e inibire la crescita eccessiva degli opportunisti indigeni attraverso diversi meccanismi:
competizione metabolica delle risorse nutritive
produzione di peptidi inibitori (i.e. batteriocine) che alterano le condizioni
dell'ecosistema per sfavorire la crescita del patogeno (i.e. abbassando il pH)
competizione sui siti di attacco sulla superficie delle cellule epiteliali e
regolazione delle risposte pro e antinfiammatorie dell'ospite
Un recupero solo parziale dei batteri commensali in seguito a IMI e terapia
antibiotica può facilitare sia lo sviluppo di nuove IMI che la recidiva di infezioni
persistenti
La terapia antibiotica alla messa in asciutta
La somministrazione intramammaria di
antibiotici alla fine della lattazione è una
componente chiave dei programmi di controllo
della mastite
Sia che venga somministrato a tutto
l’allevamento o solo ai quarti degli animali con
IMI (terapia selettiva), il trattamento alla
messa in asciutta continua ad essere uno dei
motivi principali per l'uso di antibiotici negli
allevamenti da latte
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
E’ necessaria una valutazione degli effetti delle attuali strategie di impiego di
antibiotici ai fini profilattici nella modulazione del microbiota del latte
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
Effetti della somministrazione intramammaria di
antibiotici sulla composizione del microbiota
Sebbene numerosi studi abbiano
indagato l'efficacia di vari prodotti
antimicrobici
nell'eliminazione/controllo dei
principali patogeni della mastite, vi
sono solo scarse conoscenze
riguardo agli effetti dell'uso
terapeutico e profilattico degli
antibiotici sulla composizione
complessiva del microbiota della
mammella
Non è chiaro se gli antibiotici possano avere un'influenza
duratura sulla composizione del microbiota della
mammella
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
Effetti della somministrazione intramammaria di
antibiotici sulla composizione del microbiota
Inoltre, resta da chiarire fino a che punto
le vie di somministrazione (sistemica
o intramammaria) delle varie classi di
antibiotici possano influenzare la
composizione del microbiota della
mammella
Ovviamente, la caratterizzazione del microbiota
della mammella basata sul DNA non è un
approccio valido per trarre conclusioni riguardo
alla vitalità dei vari gruppi batterici presenti o
alla persistenza delle loro infezioni
Tuttavia, gli studi attuali sottolineano la necessità
di una valutazione approfondita dell'efficacia
delle attuali strategie di terapia alla messa in
asciutta nella modulazione della composizione
del microbiota commensale della mammella
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
Effetti della somministrazione intramammaria di
antibiotici sulla composizione del microbiota
Conclusioni
Il microbiota del latte rappresenta la comunità di batteri presenti nel latte
I progressi tecnologici hanno permesso ai ricercatori di identificare il DNA dei batteri presenti nel latte
La ricerca sul microbiota del latte è ancora agli inizi e la metodologia può/deve essere migliorata
L'origine del microbioma del latte è sconosciuta, ma sono state suggerite diverse fonti
Il crescente interesse nello sviluppo di nuove terapie per il trattamento delle mastiti bovine richiede la necessità di comprendere meglio i vari fattori in grado di influenzare l'omeostasi mammaria
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
Conclusioni
Lo stato fisiologico dell’animale, le caratteristiche anatomiche della mammella, i tratti genetici associati alla risposta immunitaria e i fattori ambientali possono alterare la composizione del microbiota della mammella
Non si sa ancora abbastanza sul microbiota del latte per prendere decisioni di trattamento in base alla sua composizione; in particolare non si sa ancora se esistono profili del microbiota mammario in grado di conferire resistenza ai patogeni della mastite
La ricerca deve concentrare i suoi sforzi nel cercare di identificare i potenziali meccanismi mediante i quali i microbioti commensali dei vari compartimenti della mammella interagiscono tra loro, con i patogeni della mastite e con il sistema immunitario
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
Prospettive
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
In futuro la valutazione del microbiota del latte
potrebbe essere utilizzata per la messa a punto di sistemi
mirati di controllo:
della mastite
della sicurezza e qualità dei prodotti caseari
Collaborazioni
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
Istituto Superiore di Sanità, Roma, 17 Maggio 2019
Grazie per
l’attenzione