METODI ALTERNATIVI PER LA METODI ALTERNATIVI PER LA

RICERCA DEI MICROORGANISMI RICERCA DEI MICROORGANISMI

E PER LA VALUTAZIONE DELLA E PER LA VALUTAZIONE DELLA

LORO VITALITA’ LORO VITALITA’

Prof. Antonello PaparellaProf. Antonello Paparellaapaparella@unite.itapaparella@unite.it

1° gennaio 20061° gennaio 2006

entra in vigore il entra in vigore il

Regolamento CE 2073/05 Regolamento CE 2073/05

sui criteri microbiologici sui criteri microbiologici

applicabili ai prodotti applicabili ai prodotti

alimentarialimentari

I PRIMI EFFETTII PRIMI EFFETTI

Sensibilizzazione dei laboratoriSensibilizzazione dei laboratori

Osservanza delle procedure Osservanza delle procedure

analiticheanalitiche

Sensibilizzazione dei produttoriSensibilizzazione dei produttori

Osservanza dei criteri microbiologiciOsservanza dei criteri microbiologici

VOLONTA’ DI CONFORMARSI AI VOLONTA’ DI CONFORMARSI AI

CRITERICRITERIPuò spingere il produttore ad adottare Può spingere il produttore ad adottare

pratiche di decontaminazione su m.p. pratiche di decontaminazione su m.p.

e p.f.e p.f.

Anomala estensione della Anomala estensione della shelf-lifeshelf-life

Danni subletali e falsi negativiDanni subletali e falsi negativi

Eventuali residui indesideratiEventuali residui indesiderati

DECONTAMINAZIONE SUPERFICIALE

DEI PRODOTTI ALIMENTARI

Le soluzioni più frequenti:

Acidi organici

Etanolo

Iperclorazione

Radiazioni UV

Vapore pressurizzato

UN CASO UN CASO

PARTICOLARE: PARTICOLARE:

DECONTAMINAZIONE DECONTAMINAZIONE

DEI PRODOTTI IN DEI PRODOTTI IN

INGRESSO NELLA INGRESSO NELLA

CAMERA BIANCACAMERA BIANCA

UNA LINEA DI DECONTAMINAZIONE

SUPERFICIALE CON IPERCLORAZIONE

DA UNA LINEA

COME QUESTA,

IN CONTATTO

CONTINUO CON

IPOCLORITO, E’

STATO

ISOLATO…

un ceppo di

Listeria

monocytogenes

con particolari

performance adesive

Pratiche di decontaminazione

inefficaciCicli di congelam./scongelam.

ripetuti POTREBBERO GENERARE

FALSE NEGATIVITA’

nell’analisi microbiologica

per transizione delle cellule

microbicheda uno stato coltivabile

AD UNO STATO VITALE

NON COLTIVABILE (VNC)

CELLULE VNC (VIABLE NOT

CULTURABLE)

Escherichia coli O157:H7 (Zhao and Matthews, 2000)

Strategia di sopravvivenza in batteri non sporigeni. Dimostrata in Salmonella, Campylobacter, Escherichia, Vibrio, Streptococcus, Micrococcus ma anche in sporigeni come Bacillus subtilis.

Riduzione volumetrica da forme coccobastoncellari a piccoli corpi sferici non dotati di involucri

LA CONDIZIONE VNC NON E’ L’UNICA REAZIONE

POSSIBILE ALLO STRESS CELLULARE

“esposizione a condizioni nutrizionali

sfavorevoli, sostanze chimiche tossiche

o condizioni fisiche subottimali”

(Neidhart e VanBogelen, 2000)

STRESS NELLE CELLULE MICROBICHE

STATO FISIOLOGICO DELLE CELLULE ESPOSTE A STRESS

LE CELLULE MICROBICHE

tra la vita e la morte…

VITALI

assenza di stress crescita regolare e vitalità cellulare

STRESSATE

stress lieve crescita rallentata o bloccata ma cellule vitali

DANNEGGIATE

stress moderato crescita bloccata e diminuzione vitalità

MORTE

stress estremo inattivazione della maggior parte della popolazione

ADATTATE ALLO STRESS

stress superato risposte adattative con > tolleranza allo stress

SUICIDATE

stress lieve/moderato autolisi per > metabolismo futile

STRESS, ADATTAMENTO E SOPRAVVIVENZA

AI PROCESSI DELL’INDUSTRIA ALIMENTARE

DECONTAMINAZIONE E VNC DECONTAMINAZIONE E VNC

Maggiore probabilità in caso di:Maggiore probabilità in caso di:

Alimenti a Alimenti a shelf-lifeshelf-life estesa (ESL) estesa (ESL)Criteri microbiologici severi in Criteri microbiologici severi in

esportazioneesportazioneAlimenti con elevate cariche superficialiAlimenti con elevate cariche superficialiAlimenti con SL bloccata dalla Alimenti con SL bloccata dalla

distribuzionedistribuzione

STRATEGIE ANALITICHE IN STRATEGIE ANALITICHE IN

SITUAZIONI A RISCHIO DI SITUAZIONI A RISCHIO DI

DECONTAMINAZIONE E VNCDECONTAMINAZIONE E VNC

SE SI SOSPETTA UN FALSO NEGATIVO DA VNC SE SI SOSPETTA UN FALSO NEGATIVO DA VNC

Doppia procedura: arricchim. + Doppia procedura: arricchim. +

resuscitationresuscitation

Doppia semina: con/senza disattivanteDoppia semina: con/senza disattivanteRicerca modificazioni substrato (inibenti, Ricerca modificazioni substrato (inibenti,

pH)pH)Metodi specifici per VNCMetodi specifici per VNC

METODI PER LA STIMA DEL METODI PER LA STIMA DEL

DANNO MICROBICO DANNO MICROBICO

SUBLETALESUBLETALE

Alla ricerca delle VNC…

Metodi per stimare la vitalità

cellulare

DEFT (Jakobsen DEFT (Jakobsen et alet al 1984; Ruocco 1984; Ruocco et alet al 1991) 1991)

Riduzione del 2,3,5-Trifeniltetrazolio (Chang Riduzione del 2,3,5-Trifeniltetrazolio (Chang et alet al 1999) 1999)

Colorazione CTC-DAPI (Cappelier Colorazione CTC-DAPI (Cappelier et alet al 1997) 1997)

Bioscreen/Turbidometria(Phillips Bioscreen/Turbidometria(Phillips et alet al 1998;Paparella 1998;Paparella et et

alal 2003) 2003)

COCO22 detection time in GC (Guerzoni detection time in GC (Guerzoni et alet al 1985) 1985)

Citometria di flusso (Petrova e Donnelly, 2004)Citometria di flusso (Petrova e Donnelly, 2004)

STIMA DEL DANNO STIMA DEL DANNO

MICROBICO SUBLETALEMICROBICO SUBLETALE

NELLA BIOCONSERVAZIONE NELLA BIOCONSERVAZIONE

DEGLI ALIMENTI CON OLI DEGLI ALIMENTI CON OLI

ESSENZIALIESSENZIALI

RIDUZIONE DEL 2,3,5-RIDUZIONE DEL 2,3,5-

TRIFENILTETRAZOLIOTRIFENILTETRAZOLIO

STIMA DEL DANNO MICROBICO SUBLETALE

Studio del danno da olio essenziale in Studio del danno da olio essenziale in L.monocytogenesL.monocytogenes con riduzione del 2,3,5- con riduzione del 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (Paparella trifeniltetrazolio cloruro (Paparella et alet al

2004)2004)

AGGIUNTA DI TTC AL TERRENO COLTURALE LIQUIDO:AGGIUNTA DI TTC AL TERRENO COLTURALE LIQUIDO:

Riduzione del TTC (incolore, idrosolubile) Riduzione del TTC (incolore, idrosolubile)

formazano (rosso, insolubile)formazano (rosso, insolubile)

Valutazione quantitativa della vitalità cellulare Valutazione quantitativa della vitalità cellulare

(deidrogenasi)(deidrogenasi)

- usata in studi di fisiologia vegetale -- usata in studi di fisiologia vegetale -

Numerosi ceppi di Numerosi ceppi di L.monocytogenes L.monocytogenes sono stati esposti a sono stati esposti a

diverse % olii essenziali. La Minimal Inhibitory diverse % olii essenziali. La Minimal Inhibitory

Concentration (MIC) è stata valutata, in un primo Concentration (MIC) è stata valutata, in un primo

screening, con TTC.screening, con TTC.

Studio del danno da olio essenziale in Studio del danno da olio essenziale in L.monocytogenesL.monocytogenes con riduzione del 2,3,5- con riduzione del 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (Paparella trifeniltetrazolio cloruro (Paparella et alet al

2004)2004)

Paparella Paparella et alet al 2004 2004

CITOMETRIA DI FLUSSOCITOMETRIA DI FLUSSO

STIMA DEL DANNO MICROBICO SUBLETALE

Doppia colorazione

Secondo Ananta et al., 2004:Secondo Ananta et al., 2004:

Carbossifluoresceina diacetato Carbossifluoresceina diacetato

(cFDA) (cFDA)

Attività esterasicaAttività esterasica

Propidio ioduro (PI) Propidio ioduro (PI)

Danno di membranaDanno di membrana

Determinazione in citometria di flusso

CoulterCoulter®EPICS®XL (BeckmanCoulter ®EPICS®XL (BeckmanCoulter

Inc.)Inc.)::

FLOW RATE: 400-600 events/secFLOW RATE: 400-600 events/sec

10 000 events/sample10 000 events/sample

FL1 CHANNEL (525 FL1 CHANNEL (525 ± 20 ± 20

nm):nm):

FUORESCENZA VERDE (cF)FUORESCENZA VERDE (cF)

FL2 CHANNEL (620 FL2 CHANNEL (620 ± 15 ± 15

nm):nm):

FLUORESCENZA ROSSA (PI)FLUORESCENZA ROSSA (PI)apaparella@unite.it

GateFluorescenz

a delle cellule

Possibile spiegazione del meccanismo cellulare coinvolto

G1 cF- and PI+

Attività esterasica non rilevabile, membrana

compromessa

G2 cF+ and PI+ Esterasi attiva,membrana danneggiata

G3 cF- and PI- Attività esterasica non rilevabile, membrana intatta

G4 cF+ and PI- Esterasi attiva,membrana intatta

Gate delle cellule colorate con cF e PI (Ananta et al., 2004)

apaparella@unite.it

Sottopopolazioni dopo doppia colorazione con cF

e PI

GATE 4

VITALI

GATE 2

DANNEGGIATE

GATE 1

INATTIVATE

GATE 3

BASSA FLUORESCENZA

FL1 CHANNEL: cF

FL2 C

HA

NN

EL: P

I

apaparella@unite.it

TURBIDOMETRIA/BIOSCREENTURBIDOMETRIA/BIOSCREEN

STIMA DEL DANNO MICROBICO SUBLETALE

4% NaCl

O.D

. (6

00

nm

)

Time (Hrs)

Effetto dell’aggiunta di NaCl durante

i trattamenti con differenti % OE

Origano

Time (Hrs)

O.D

. (6

00

nm

)ATCC 19114

0% NaCl

VALUTAZIONE DELLA VALUTAZIONE DELLA

PERMISSIVITA’ DEL SUBSTRATOPERMISSIVITA’ DEL SUBSTRATO

DECONTAMINAZIONE SUPERFICIALE DECONTAMINAZIONE SUPERFICIALE

DEI PRODOTTI A BASE DI CARNEDEI PRODOTTI A BASE DI CARNE

MICROBIOLOGICAL CHALLENGE TESTMICROBIOLOGICAL CHALLENGE TEST

E MODELLAZIONE DEI RISULTATI E MODELLAZIONE DEI RISULTATI

((L.monocytogenesL.monocytogenes) )

PRODOTTI STUDIATI:

Prodotti a base di carne: prosciutto

crudo, coppa, lardo

SCOPO:

Decontaminazione superficiale in camera

bianca (prima dell’affettatura)

OBIETTIVO MICROBICO:

Diminuzione dell’inoculo (L. monocytogenes

ATCC19114)

CHALLENGE TEST:

Cocktail di 5 ceppi di L. monocytogenes:

ATTC19114 + 4 ceppi isolati da prodotti a base

di carne

(1 x 105 UFC/cm2)

DISEGNO SPERIMENTALE (E MODELLAZIONE):

Effetto interattivo di NaCl, acido lattico e % olio

essenziale sulla diminuzione logaritmica

dell’inoculo

Effetto dell’aggiunta di NaCl durante il trattamento con

differenti % olio essenziale di origano, con (a) o senza

(b) emulsionante (lecitina)

Logarithmic decrease (LogMPN) = 7,07x[EO] -

1,353x[NaCl] - 0,785x[NaCl]2 - 11,43x[Lactic

Ac.]2 - 22,26x[EO]x[Lactic Ac.] +

13,87x[NaCl]x[Lactic Ac.]

Logarithmic decrease (LogMPN) =

5,58x[EO] - 3,29x[Lactic Ac.] -

2,33x[EO]2 -1,39x[EO]x[NaCl]

+3,03x[NaCl]x[Lactic Ac.]

NUOVE NORME PIU’ FLESSIBILI

CONCLUSIONICONCLUSIONI

SEMPRE PIU’ FREQUENTE LA DECONTAMINAZIONE

RISCHIO DI FALSI NEGATIVI NELL’ANALISI MICROBIOLOGICA

STRATEGIE E METODI GIA’ DISPONIBILI

Grazie per l’attenzione!

Prof. Antonello PaparellaProf. Antonello Paparellaapaparella@unite.itapaparella@unite.it