Post on 15-Feb-2019
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Modificazione selettiva o casuale di una proteina allo scopo di modificare la struttura o la funzione
Ingegneria proteica
PROGETTARE
PRODURRE CARATTERIZZARE
MODULARE ATTIVITA’ O INTRODURRE NUOVE FUNZIONI
APPLICAZIONI
INDUSTRIA
MOLECOLE STABILI ED ATTIVE IN CONDIZIONI PARTICOLARI DI PH, TEMPERATURA E CONDIZIONI DI REAZIONE
BIOMEDICINA
MOLECOLE STABILI ED ATTIVE IN CONDIZIONI FISIOLOGICHE, IN PRESENZA DI ENZIMI ED INIBITORI, AD EMIVITA LUNGA E DA VEICOLARE EFFICACEMENTE AI BERSAGLI CELLULARI
IN UN ESPERIMENTO DI INGEGNERIA PROTEICA SI POSSONO MODULARE MOLTE PROPRIETA’ DI UNA MOLECOLA
ALTRI PARAMETRI BIOLOGICI E CLINICI
Proprieta’ generali RESIDUI IDROFOBICI ESPOSTI SOLUBILITA’
SITI DI LEGAME AFFINITA’ SPECIFICITA’
TERMINALI FUSIONI CON PEPTIDI O PEG
LOOPS RESISTENZA PROTEOLISI
NUCLEO STABILITA’ CONTROLLO CONFORMAZIONALE
EPITOPI IMMUNOGENICITA’
DESIGN RAZIONALE EVOLUZIONE GUIDATA
Bioinformatica Genomica strutturale Genomica funzionale
Biochimica strutturale
(NMR, X-ray, Massa)
IDENTIFICAZIONE MOLECOLA
RACCOLTA INFORMAZIONI
Ingegneria genetica Ingegneria proteica Ingegneria metabolica
BIOMOLECOLE ATTIVE
L’INGEGNERIA PROTEICA RICHIEDE UN APPROCCIO MULTIDISCIPLINARE
lamB
lamB
promotore terminatore
lamB RBS
Di cosa ho bisogno per esprimere una proteina?
UN GENE
UNA UNITA’ DI TRASCRIZIONE
UNA UNITA’ DI TRADUZIONE
STOP
DNA RICOMBINANTE ED INGEGNERIA PROTEICA
Alcuni punti importanti da rispettare: Qualità del prodotto proteico e Resa del sistema di produzione. Rapporto qualità/costo vantaggioso. Assenza di agenti infettivi per l’uomo.
FASI SPERIMENTALI PRINCIPALI
1: Identificazione, isolamento e clonaggio gene codificante per proteina bersaglio
2: espressione in sistema eterologo
3: purificazione e caratterizzazione proteina wild type
4: progettazione, produzione e caratterizzazione versioni mutate
FASE 1: isolamento gene codificante
- INFORMAZIONI SULLA PROTEINA DI INTERESSE -INFORMAZIONI SU PROTEINE OMOLOGHE
(STRUTTURA/FUNZIONE) -ANTICORPO SPECIFICO
⇓ - ISOLAMENTO (SINTESI) SEQUENZA CODIFICANTE
⇓ - ANALISI DI COLLEZIONI DI MOLECOLE (GENI O PRODOTTI) - REAZIONE A CATENA DI POLIMERASI TERMOSTABILI (PCR)
- SINTESI CHIMICA EX NOVO ⇓
-DETERMINAZIONE SEQUENZA NUCLEOTIDICA E CLONAGGIO
Alcuni casi difficili proteina e/o mRNA poco abbondante proteina oligomerica cofattori e/o gruppi prostetici
Controllo trascrizionale Controllo traduzionale Controllo post-traduzionale
RNA polimerasi
Velocità di traduzione
Stabilità mRNA
Ribosoma mRNA
Proteina
Modificazioni
post-traduzionali
Compartimenti
(periplasma procarioti)
DNA
procarioti
eucarioti
L’espressione eterologa di una proteina segue le regole della cellula ospite
-Scelta coppia sistema di espressione/ospite dipende dalle caratteristiche molecolari della proteina di interesse ( importanza di qualità e resa).
-Procarioti o eucarioti? Differenze (vantaggi e svantaggi):
- Compartimentalizzazione - Uso del codice genetico (tRNA) - Stabilità cloni ricombinanti - Modificazioni post-traduzionali - Resa in biomassa - Purificazione - Crescite terreni modificati (isotopi o metalli pesanti) - Costo - fattibilità su piccola scala e larga scala
(a) Sistemi di espressione procariotici (Rese: µg-mg/litro coltura)
- Ospite più utilizzato: Escherichia coli -Plasmidi e virus batterici
1. Caratteristiche vettore
2. Efficienza trascrizionale
2. Efficienza traduzionale
3. Stabilità della proteina
DNA RNA Proteina
Parametri principali nei procarioti
NUMERO DI COPIE PER CELLULA: -Derivati di pBR322: 15-20 copie per cellula - Derivati di pUC: 150-200 copie per cellula
Il numero di copie influenza: - positivamente la stabilità del plasmide, cioè la sua presenza nelle generazioni successive. -negativamente la velocità di crescita del ceppo ospite: crescono meglio le cellule con meno copie.
I PLASMIDI AD ALTO NUMERO DI COPIE NON SEMBRANO CONFERIRE UN VANTAGGIO PER LA PRODUZIONE DELLA PROTEINA
VETTORE DI ESPRESSIONE PROCARIOTICO
SELEZIONE: Ampicillina, tetraciclina, kanamicina Sconsigliata ampicillina perché:
- perdita di resistenza - potenzialmente allergenica
Densità cellulare
Tempo di crescita
Fase lag
Fase logaritmica
Fase stazionaria
Morte cellulare
PROMOTORE: COSTITUTIVO O INDUCIBILE??
Promotore Induzione altrolac IPTG lattosiotac IPTG “trc IPTG “T7 IPTG “trp Trp
mancanzaAnalogo acidoindolacetico
araBAD L-ArabinosePL(l) termica Espr.basale/induzione
di hspPR(l) termica “lac(TS) termicaPSPA Costitutivo
PROMOTORE (costitutivo o inducibile): -costo dell’induttore -efficacia dell’induzione e della repressione in condizioni di non-induzione per bilanciare produzione di biomassa e resa in proteina -forza del promotore e resa in proteina (solubile)
E.coli lambda lisogeno (λDE3)
Il sistema di espressione pET
SEGNALI RELATIVI ALLA TRADUZIONE:
-SEQUENZA SHINE-DALGARNO OTTIMALE
5’-UAAGGAGG-3’
- POSIZIONE: 4-8 NUCLEOTIDI DA AUG (rimozione N-terminale?)
- SECONDO CODONE: di solito ricco in A nei geni molto espressi. AAA(lys) è frequente (13%).
- 5’ RICCO IN GC DIMINUISCE EFFICIENZA TRADUZIONE
CODON USAGE USO DI CODONI RARI PUO’ PORTARE A PROBLEMI: STABILITA’ mRNA DIMINUITA TERMINAZIONE PREMATURA DI TRASCRIZIONE/TRADUZIONE FRAMESHIFT, DELEZIONI, INCORPORAZIONI ERRATE INIBIZIONE DELLA CRESCITA CELLULARE
CODONI USATI CON FREQUENZA BASSA NELLE VARIE SPECIE (tRNA meno abbondanti)
FREQUENZA DI USO DEI CODONI RARI DI E.coli IN ALTRE SPECIE
ESPRIMERE IN E.COLI UN GENE RICCO IN CODONI RARI ABBASSA LA EFFICIENZA DI TRADUZIONE
BL21 (DE3)CodonPlus-RIL
AGG/AGA(arginine),AUA(isoleucine)and CUA(leucine)
Stratagene
BL21 (DE3)CodonPlus-RP
AGG/AGA(arginine)and CCC(proline)
Stratagene
Rosetta orRosetta (DE3)
AGG/AGA(arginine),CGG(arginine),AUA(isoleucine)CUA(leucine),CCC(proline),and GGA(glycine)
Novagen
CEPPI DI E.COLI CHE ESPRIMONO tRNA RARI
QUALI SOLUZIONI?
-Geni mutati o costruiti (sintetici)
CEPPI CHE ESPRIMONO MENO PROTEASI
MANCATA O BASSA ESPRESSIONE
LA PROTEINA VIENE ESPRESSA IN CONDIZIONI NON DI INDUZIONE
* ESPRESSIONE COSTITUIVA DI UN REPRESSORE lac repressor(the lacI or lacIq) PER PROMOTORE LAC * USARE UN PROMOTORE STRINGENTE, e.g. the arabinose promoter (PBAD). * USARE PLASMIDE A BASSO NUMERO DI COPIE * VETTORI PET: USARE CEPPI CON T7 Lisozima from a compatible pLysS or pLysE plasmid (Novagen). IL LISOZIMA SI LEGA ALLA POLIMERASI ED INATTIVA L’ENZIMA IN ASSENZA DI INDUTTORE • AGGIUNGERE 1% glucosio PER REPRIMERE IL PROMOTORE lac INDOTTO DA LATTOSIO PRESENTE NEI MEZZI DI COLTURA MASSIMI ( LB, 2xYT).
LA STABILITA’ DEL PLASMIDE E’ BASSA
*AUMENTARE LA CONCENTRAZIONE DELL’ANTIBIOTICO DI SELEZIONE
LA PROTEINA E’ TOSSICA
*ESPRESSIONE NEL PERIPLASMA O IN CORPI INCLUSI
LA PROTEINA RICOMBINANTE DEVE ESSERE SOLUBILE
SPESSO SI HA LA FORMAZIONE DI CORPI INCLUSI
(aggregati proteici insolubili in acqua)
STRATEGIE PER AUMENTARE LA SOLUBILITA’
RIDURRE LA VELOCITA’ DI TRADUZIONE
* ABBASSARE LA TEMPERATURA DI CRESCITA * USARE UN PROMOTORE PIU’ DEBOLE * USARE UN PLASMIDE A BASSO NUMERO DI COPIE * ABBASSARE LA CONCENTRAZIONE DI INDUTTORE
CAMBIARE LE CONDIZIONI DI CRESCITA * AGGIUNGERE COFATTORI NECESSARI PER FOLDING * CONTROLLARE LE VARIAZIONI DI PH * AGGIUNGERE GLUCOSIO 1% PER REPRIMERE LA ESPRESSIONE
DEL PROMOTORE LAC INDOTTO DA LATTOSIO PRESENTE NEI TERRENI MASSIMI ( LB, 2xYT).
* AGGIUNGERE ETANOLO, TIOLI A BASSO PESO MOLECOLARE, NaCl.
CO- ESPRIMERE CON IL GENE DI INTERESSE CON:
ALTRE SUBUNITA’ DELL’OLIGOMERO
CHAPERONES MOLECOLARI
* GroES-GroEL * DnaK-DnaJ-GrpE * ClpB
FOLDASI
• PEPTIDIL -PROLIL CIS/TRANS ISOMERASI (PPI's) • DISULFURO-OSSIDOREDUTTASI (DsbA) • DISULFURO ISOMERASI (DsbC) • PROTEINA DISOLFURO ISOMERASI (PDI) – EUCARIOTICA- CATALIZZA SIA OSSIDAZIONE DELLE CISTEINE CHE DSI: HA ANCHE ATTIVITA’ CHAPERONE.
ESPRIMERE LA PROTEINA NEL PERIPLASMA MEDIANTE AGGIUNTA DI UNA SEQUENZA SEGNALE (pelB/ompT)
• L’AMBIENTE E’ PIU’ OSSIDANTE CHE NEL CITOPLASMA • SONO PRESENTI DsbA E DsbC • ATTIVITA’ PROTEOLITICA RIDOTTA • PERMETTE ACCUMULO DI PROTEINE TOSSICHE NEL CITOPLASMA • N-TERMINALE VERO
Svantaggi: livelli di espressioni minori
USARE CELLULE OSPITI “SPECIALI” CON CITOPLASMA OSSIDANTE
CEPPI COMMERCIALI
* AD494, mutato nella tioredossina reduttasi (trxB). * Origami, mutato nella tioredossina reduttasi (trxB) e glutatione reduttasi (gor).
PRODURRE UNA PROTEINA DI FUSIONE CON PROTEINA SOLUBILE
MALTOSE-BINDING PROTEIN UBIQUITIN DsbA TIOREDOSSINA IgG-BINDING DOMAIN
SVANTAGGI: RECUPERO DELLA PROTEINA MEDIANTE PROTEOLISI
ESPRIMERE FRAMMENTI SOLUBILI DELLA PROTEINA
IN ALCUNI CASI LA ESPRESSIONE NEI CORPI INCLUSI PUO’ ESSERE UN VANTAGGIO:
• LA PROTEINA RICOMBINANTE E’ FINO AL 50% DELLE PROTEINE TOTALI
• E’ PROTETTA DALLA DEGRADAZIONE • NON PUO’ ESSERE TOSSICA PER LA CELLULA
LA PROTEINA NATIVA DEVE ESSERE RECUPERATA MEDIANTE DENATURAZIONE IN VITRO E REFOLDING
*ISOLAMENTO DEI CORPI INCLUSI. SHOCK OSMOTICO E CENTRIFUGAZIONE
*DENATURAZIONE IN PRESENZA DI AGENTI DENATURANTI COME GUANIDINA O UREA O CONDIZIONI RIDUCENTI (e.g. DTT).
*REFOLDING DELLA PROTEINA MEDIANTE LENTA RIMOZIONE DEL DENATURANTE CON DIALISI, DILUIZIONE O CROMATOGRAFIA (IN PRESENZA DI AGENTI RIDUCENTI )