oncoematologia

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Ana Valencia Martinez

Università degli Studi di Firenze

CITOGENETICA CONVENZIONALE IN ONCOEMATOLOGIA

La parte della genetica responsabile dello studio microscopico dei cromosomi. Consente l’identificazione degli individui con un numero anomalo di cromosomi o di cambiamenti strutturali. I citogenetisti fanno uso di tre caratteristiche per l’identificazione e classificazione dei cromosomi:

• Elementi morfologici: grandezza, forma

• Bandeggio: G, Q, R

Citogenetica

Posizione del centromero

braccio corto

braccio lungo

Bandeggio cromosomico

La colorazione dei cromosomi con opportune sostanze permette di ottenere lungo ciascun cromosoma una serie di bande specifiche di intensità variabile secondo un modello costante e riproducibile. Bandeggi generali: G, Q, R

Bandeggio cromosomico

Bandeggio cromosomicoInterfase

Profase

Metafase

Anafase

Telofase

Citocinesi

CARIOTIPO

Anomalie cromosomicheAnomalie di numero

Anomalie di struttura

Anomalie strutturali

DELEZIONE: perdita di un segmento cromosomico, terminale o interstiziale

Anomalie strutturaliDUPLICAZIONE di un segmento cromosomico, diretta o inversa a seconda che conservi l’originale disposizione

rispetto al centromero o ruoti di 180°

INSERZIONE: inserimento di un segmento di cromosoma, terminale o interstiziale.

TRASLOCAZIONE: trasferimento reciproco di una parte di un cromosoma sull’altro cromosoma

a b a b

Cariotipo

International System for Human Cytogenetic Nomenclature (ISCN, 2009)

La formula del cariotipo si scrive utilizzando una nomenclatura standard internazionale.

46,XY[20]45,XX,-7[20]47,XY,+21[20]46,XX,t(9;22)(q34;q11)[20]46,XX,t(9;22)(q34;q11)[5]/47,idem,+8[15]

Anomalie cromosomiche

XX,del(5)(q12q34),-13,der(17),t(17;18)(p12;q11),-18,der(19),t(1;19)(q12;p13),-21,+2mar45,

Colorazione (bandeggio)

Selezione e cattura immagini

Elaborazione e cariotipizzazione

Conclusione diagnostica

(CC)Cariotipo Convenzionale

Aspirato midollare

Conteggio nucleate

Semina in terreno

Coltura per 24 - 48h

Colchicina

Fissazione e lavaggi

Allestimento dei vetrini

Proprietà del DNA di catena singola di ibridare con sequenze complementari.

Le sonde di DNA vengono marcate con fluorocromi e si visualizzano al microscopio.

Permette l’analisi di un maggiore numero di cellule.

Si può applicare in cellule in interfase (SP o MO).

Colorazione (bandeggio)

Selezione e cattura immagini

Elaborazione e cariotipizzazione

(CC)Cariotipo Convenzionale

Aspirato midollare(sangue periferico)

Conteggio nucleate

Semina in terreno

Coltura per 24 - 48h

Colchicina

Fissazione e lavaggi

Allestimento dei vetrini

Scelta delle sonde

Denaturazione e Ibridazione over night

Lavaggi econtrocolorazione

Valutazione immagini

Cattura / elaborazione

(FISH)Ibridazione in Situ

Citogenetica oncoematologica

L’analisi citogenetica in ematologia:

- definizione diagnostica - stratificazione prognostica

- comprensione dei meccanismi patogenetici

SINDROMI MIELODISPLASTICHE

Definizione Le sindromi mielodisplastiche sono un gruppo di malattie del midollo osseo

caratterizzate dalla incapacità delle cellule progenitrici di maturare normalmente:

- midollo oseo: ematopoiesi clonale e inefficace - sangue periferico: citopenie periferiche

- progressiva insufficienza midollare- rischio di progressione in LAM

Patofisiologia

Celulla progenitrice

Stroma/Factori

angiogenici

Mutazioni/Danno del DNA

Epigenetica

Differenziazione

Apoptosi

Sistema inmune

Tossicitàdiretta

ambientale

Valutazione morfologica (qualitativa, quantitativa)

Istologia su biopsia osteomidollare

Immunofenotipo

Citogenetica

Biologia Molecolare

Inquadramento diagnostico

CITOGENETICA CONVENZIONALE

Alterazioni cromosomiche sono dimostrabili nel:

In generale, le alterazioni ricorrenti nelle SMD sono le delezioni cromosomiche, ma anche le perdite o le acquisizioni di interi cromosomi.

Alterazioni citogenetiche

30-50% SMD de novo70-80% SMD secondarie

Alterazioni citogenetiche

Favorevole del(5q) del(20q)

-Y del(12p) del(9q)

+21 del(15q)

Intermedio +8

t(11q23) Rea 3q

-7/del(7q) del(11q) del(15q) del(17q)

Sfavorevole t(5q)

complesso

Morel P. Leukemia. 1993 Sep;7(9):1315-23. (n= 408) ToyamaK. Leukemia. 1993 Apr;7(4):499-508. (n= 401)

Sole F. Haematologica. 2005 Sep;90(9):1168-78. (n= 908) Hasse D. Blood. 2007 Dec 15;110(13):4385-95.(n= 2124)

Pozdnyakova O. Cancer. 2008 Dec 15;113(12):3331-40. (n= 1024)

del(5q)

del(5q), isolata o in combinazione, osservata nel 15% dei casi totali e 30% dei casi alterati.

Entitá clinica definita nella classificazione WHO: “sindrome 5q-”.

del(5q)

Più frequente nei soggetti di sesso femminile. Anemia macrocitica con un numero normale o aumentato di

piastrine. Displasia megacariocitica (megacariociti ipolobulati). Blasti inferiore al 5%. del(5q) come unica alterazione del cariotipo. Generalmente con prognosi favorevole.

Sindrome 5q-

Monosomia-delezione crom. 7 Anomalie riscontrabili nel 10% di forma

isolata o in combinazione.

Associata a prognosi sfavorevole.

30% dei pazienti con SMD secondaria: +8, del(5q), del(20q), del(17p).

del(7q22) in topi non ha fenotipo specifico.

Trisomia 8

Presente in forma isolata nell’8% dei casi a rischio intermedio.

Tra le alterazioni più frequenti di tutti i sottotipi WHO.

Perdita Y e del(20q) Gruppo di rischio favorevole.

10% dei pazienti presenta perdita Y: associato all’età e ad altre patologie non ematologiche.

del(20q) osservata nel 5-7%. CDR (q11-q13) include 19 geni nessuno coinvolto con la patogenesi delle SMD.

EMATOPOIESICLONALE

IPSS Favorevole

Normale del(5q) del(20q)

Sfavorevole Anomalie crom 7

Complesso (≥ 3 anomalie)

, -YIntermedio

+8 Altre anomalie

Nuova classificazione citogenetica

MoltoFavorevole Favorevole Intermedio Sfavorevole Molto

Sfavorevole

Isolata:del(11q)

NormaleIsolata:der(1;7)del(5q)

del(12p)del(20q)

Doppie con 5q-

Isolata:7q-+8

i(17p)+21+19

Altre singole

Altre doppieDoppie con

–7/7q-

Complesso3 anomalie

Isolata:der(3)(q21q26)

Complesso>3 anomalie

Schanz J. JCO 2012

LEUCEMIA MIELOIDE ACUTA

Definizione

È un tumore maligno caratterizzato da proliferazione di cellule immature (blasti) che hanno origine dal midollo osseo e da alterata produzione di cellule normali del sangue.

Nei blasti è presente una alterazione dei meccanismi che regolano la proliferazione e la differenziazione della cellula staminale, impedendo la maturazione della sua progenie.

Definizione

Progenitori mieloidiCMH

Eritrociti

Piastrine

Granulociti

Macrofaghi

Mutazione Mutazione Espansione clonale

EmatopoIesi normale

Leucemia Mieloide Acuta

Classificazione WHO 2008

Traslocazioni ricorrenti

Classificazione citogenetica

Favorable t(8;21); inv(16), t(15;17)

Intermedio Normal, +8, +21, +22, abn(11q23), del(9q), otras

Desfavorable -5/del(5q), -7/del(7q), abn(3q), 20q, 21q, 17p, t(6;9), t(9;22), cariotipos complejos con 3(5) anomalías

RC (%) RR (%) SG (%)

84 - 91 21 - 35 55 - 65

76 - 86 51 - 67 24 - 41

63 - 22 63 - 22

Grimwade et al. Blood 1998

40 - 50%

Strategie terapeutiche

Better risk

Poor risk

Intermediate risk

LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA

Leucemia Mieloide Cronica

Disordine mieloproliferativo della cellula staminale emopoietica.

Incidenza: 1-2/100000 per anno.

15-20% delle Leucemie dell’adulto. L'età media alla diagnosi è di 45-55 anni.

Rapporto M/F:1,7/1.

Leucemia Mieloide Cronica

Diagnosi facile:

- quadro ematologico caratteristico

- marcatore citogenetico specifico

Cromosoma Philadelphia

t(9;22)(q34;q11)

Citogenetica convenzionale

Metodo standard nella diagnosi della LMC. Permette la conferma della presenza della

t(9;22) e di alcune varianti. Monitoraggio della risposta al trattamento fino

alla RCC. Dopo sensibilità limitata.

Risposta citogenetica

Risp. Citogen. Completa (RCC): 0% cell. Ph(+). Risp. Citogen. Parziale (RCP): 1-35% cell. Ph(+). Risp. Citogen. Maggiore (RCM): 0-35% cell. Ph(+). Risp. Citogen. Minore (RCm): 36-65% cell. Ph(+). Risp. Citogen. Minima: 66-95% cell. Ph(+). Risp. Citogen. Nulla: >95% cell. Ph(+).

Variabilità citogenetica

Traslocazioni Ph (+) criptiche Traslocazioni varianti Delezione(9q) (5’ ABL) Evoluzione clonale: Clonal cytogenetic

abnormalities (CCA)

5-10% dei casi di LMC sono Ph (-)

50%: si può dimostrare t(9;22) per FISH (Ph

“mascherato”) oppure il trascritto Bcr-Abl per biologia molecolare

I casi Ph(-)Bcr-Abl(-) costituiscono un gruppo

eterogeneo, con peggiore evoluzione clinica [LMC

Ph (-), LMCa, LMMC e altri MPNC].

Variabilità citogeneticaTraslocazioni criptiche

3-5% dei pazienti con LMC Ph (+) presentano traslocazioni varianti dove sono coinvolti altri cromosomi.

Prognosi simili ai pazienti con traslocazione classica..

Valencia et al. Advances of Hematology 2008

Variabilità citogeneticaTraslocazioni varianti

Evoluzione clonaleClonal chromosome abnormalities (CCA/Ph+)

L’acquisizione di CCA aggiuntive associate a progressione della malattia.

60-80% nelle fasi avanzate si trovano CCA Le più frequenti sono +8, der(22), +19 e i(17q). Altre: -Y, -7, +21.

Evoluzione clonaleClonal chromosome abnormalities (CCA/Ph+)

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10 11 12

13 14 15 16 17 18

19 20 21 22 X Y

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