Programmi di sequenziamento genomico nelle piante

•Arabidopsis

•Riso

•Pioppo

Già completati

•Mais

•Pomodoro

•Soia

•……etc.

Analisi funzionale dei geni

•Mutagenesi inserzionale

•RNA Antisenso

•RNAiDiminuire l’espressione

(Knock out)

•Mutagenesi inserzionale

•Mutagenesi inserzionale su larga scala

•T-DNA tagging

•Trasposon tagging

Il trasferimento genico nelle Il trasferimento genico nelle piantepiante

•Vettore biologico: Agrobacterium, virus

Mediato da:

•Diretto: biolistico, microiniezione, etc

Agrobacterium tumefaciens e rhizogenes

Agrobacterium tumefaciens

• E’ un patogeno delle piante responsabile del tumore (la galla)

• La trasformazione delle cellule della pianta è conseguenza del trasferimento e dell’integrazione nel genoma nucleare della cellula target di una regione (T-DNA) del plasmide Ti (Tumor-inducing)

LB

RB

vir

ori

A

B

GC

D

E

opinecatabolism

oncogenesand opinesynthase

T-DNA

Ti

LB

RB

vir

ori

A

B

GC

D

E

opinecatabolism

oncogenesand opinesynthase

T-DNA

Ti

L’integrazione del T-DNA nel genoma

dell’ospite è casuale

NOS-pro

NOS-t NOS-t NPTII(KanR)

CaMV35S

gene X

Vettore a T-DNA

RB LB

Trasformazione mediata da Trasformazione mediata da Agrobacterium Agrobacterium tumefacienstumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

plasmide

helper

Trasforma senza indurre il tumore (disarmato)

Piantine trsformanti (verdi; KanR) di Arabidopsis thaliana

Arabidopsis thaliana (pianta modello) il cui genoma è stato completamente sequenziato ( 2000)

225.000 linee inserzionali (T-DNA)

Arabidopsis Biological Stock Center (Ohio S.U.)

Nothingham Arabidopsis stock center (NASC)

Breve sequenza del DNA genomico fiancheggiante l’inserto permette di stabilirne la posizione nel genoma

Trasposoni

Barbara McClintock (1902 –1992)

Ds dissociation (non autonomo); Ac Activator (autonomo)

Ac: 4563 bp

IR : sequenze ripetute (imperfette) terminali 11bp

Un gene che codifica per la trasposasi (807 aa)

Assegnare una funzione ai geni

la sequenza del genoma:

Individuare, clonare e caratterizzare geni (anche su larga scala)

•è disponibile

•non è disponibile

Come può essere utilizzato il trasposon (e T-DNA tagging)

Trasposizione generalizzata Mu (mais)

Trasposizione “bersaglio” specifica Ac/Ds

(tutto il genoma)

(una regione genomica)

•70-90% degli elementi Mu si inserice nei geni

•le inserzioni si verificano tardivamente nelle cellule germinali

•si inseriscono con alta frequenza sia in loci associati che non associati e qui rimangono stabili e trasmissibili attraverso la linea germinale

•non vengono persi e continuano a replicarsi (saturation mutagenesis)

Mu (mutator)

Elemento Mu

Rescue Mu

Consiste in un plasmide inserito in un elemeto Mu non autonomo

•Lc (Leaf color): fattore trascrizionale richiesto per la prod. antocianine

•pBluescript: plasmide batterico ad alto numero di copie

•viene cotrasformato con pAHC20 (resistenza al Basta)

•le linee cotrasformate devono esser incrociate con una linea che porta un MuDr attivo per potere trasporre.

Rescue Mu

• Accelerare la scoperta e la caratterizzazione di geni mutagenizzati con Mu che presentino un fenotipo di interesse

•Recupero del plasmide 5-20 Kb di DNA, fiancheggiante l’elemento Mu, in forma plasmidica facilmente sequenziabile (non occorre costruire una libreria genomica del mutante)

•Una nuova risorsa per costruire librerie batteriche di DNA genomico di Mais arricchito in sequenze eucromatiche

•Non solo inserzioni germinali, ma anche somatiche tardive (cellule della foglia)

•Difficilmente danno un fenotipo e difficilmente vengono trasmesse alla progenie