Regolazione dell’Espressione Genica

Puo’ essere regolata in una delle seguenti sei fasi:

DNA RNAtranscript

mRNA mRNA

inactivemRNA

protein

inactiveprotein

NUCLEUS CYTOSOL

trascrizione Maturazione trasporto traduzione

degradazione

controllo dell’attivita’

Metodi per studiare l’espressione dei geni• Northern blot• Trascrittasi Inversa -PCR (RT-

PCR)• Ibridazione In situ• Trascrizione In vitro• DNA Microarray

Purificazione dell’RNA

• Procedura – Lisi delle cellule con un reagente

che dissocia le nucleoproteine e inibisce la RNAsi

– Rimozione delle proteine– Precipitazione specifica dell’RNA

Northern blot

• Per determinare la dimensione e la quantita’ di specifici mRNA

• Studi sull’espressione genica

Northern blot– Elettroforesi dell’RNA in gel

contenente formaldeide per mantenere l’RNA in forma completamente lineare

– Trasferimento dell’RNA su una membrana

– Ibridazione con una sonda marcata

100V 0,2A

+-

generatore di corrente

gel di agarosio

scatola elettroforetica

tampone elettroforeticoes. TAE (4mM Tris-acetato, 1mM EDTA, pH 8.0)

Gel Elettroforesi-

Separa le molecole in base alla dimensione

Trasferimento su supporto solido

Trasferimento dal gel alla membrana

gel

membrana

Dopo il trasferimento

Preparare la sonda per il Northern Blot

Ibridazione

• La sonda marcata e’ aggiunta ad una soluzione contenente il supporto solido che lega l’RNA da analizzare

Lavaggio

• Rimozione della sonda non legata al supporto solido

Rivelazione degli ibridi

• Esposizione di un film se la sonda e’ marcata radioattivamente

• Se la sonda e’ marcata con un enzima si procede alla reazione enzimatica che produce colore direttamente sul supporto solido

Northern blot

• La rivelazione avviene usando:– DNA marcato con

radioattivo(32P)

– DNA marcato con un enzima che catalizza una reazione che produce luce o colore

Fig. 5. Northern blot analysis of E. lagascae total RNA from leaves (L), germinating seeds (Se), roots (Ro) and stems (St). The blot was hybridized with probes for ElLTP1 (top panel) and ElLTP2 (middle panel). The bottom panel shows ethidium bromide staining of the gel before blotting. The numbers to the left indicate approximate transcript sizes in kb

Northern blot

Svantaggi del Northern Blot

• Richiede grandi quantita’ di RNA

• E’ un processo lungo e laborioso

AMPLIFICAZIONE IN AMPLIFICAZIONE IN VITRO DEL DNAVITRO DEL DNA

““REAZIONE A CATENA REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASIDELLA POLIMERASI

(PCR)”(PCR)”

• Inventata da Kary Mullis negli anni ‘80 (premio Nobel 1993)

• Serve per ottenere una grande quantita’ di una specifica sequenza di DNA in vitro

• Puo’ amplificare un tratto di DNA per piu’ di 1 milione di volte

PCR: reazione polimerasica a catena

ELEMENTI NECESSARI ALLA REAZIONE:

1- DUE OLIGONUCLEOTIDI COMPLEMENTARI A DUE REGIONI CHE SI TROVANO SU FILAMENTI OPPOSTI DEL DNA STAMPO AI LATI DELLA REGIONE CHE SI VUOLE AMPLIFICARE

2- DNA STAMPO CHE CONTENGA LA REGIONE DA AMPLIFICARE

3- POLIMERASI TERMOSTABILE (NON VIENE DENATURATA SE PORTATA A 95° C)

4- I 4 DESOSSINUCLEOTIDI TRIFOSFATI

IL PROCESSO DI PCR PREVEDE UN CERTO NUMERO DI CICLI. OGNI CICLO CONSISTE DI 3 PASSAGGI:

1- DENATURAZIONE: TEMP. 95°C. IL DNA STAMPOVIENE DENATURATO, I DUE FILAMENTI SI SEPARANO

2-APPAIAMENTO: 55°C CIRCA. I PRIMERS SI APPAIANOCON IL DNA STAMPO

3- SINTESI: TEMP.72°C E’ OTTIMALE PER IL FUNZIONAMENTO DELLA Taq (Termus aquaticus) POLIMERASI

PCR: Reazione a catena della polimerasi

Metodo di amplificazione del DNA usando una polimerasi termostabile quale la Taq DNA polimerasi, uno stampo di DNA, un eccesso di primers e dideossinucleotidi (dNTP) in un buffer.

PCR: Reazione a catena della polimerasi

PCR: Reazione a catena della polimerasi

PCR: amplificazionePCR: amplificazione

n.ro cicli

1

3

10

15

20

25

30

n.ro sequenze bersaglio

0

2

256

8192

262.144

8.388.608

268.435.456

La sequenza bersaglio è la sequenza di DNA sintetizzata tra i due primers

Occorre ~1g di DNA per l’analisi di una sequenza o una digestione con enzimi di restrizione tali da poter essere visibili in elettroforesi. Se vi sono ~5 pg di DNA/cellula umana (5x10 -12g) allora ~1 g of DNA potrebbe essere isolato da 200.000 cellule ma avremmo un miscuglio di tutti i geni.

In 1 g di DNA genomico, una copia singola di un gene (300 bp) equivarrebbe a ~0.1 pg di DNA.

Questo 0.1 pg di DNA potrebbe essere amplificato mediante PCR producendo 0.8 g in 25 cicli e 27 g in 30 cicli.

PCRVANTAGGI:• Sensibilita’• Rapidita’• Si presta all’analisi simultanea di molti campioni (high throughput)• Si presta all’analisi simultanea di diverse sequenze sullo stesso

campione• Si presta all’analisi di DNA degradato o incluso in mezzi strani, o

fissato• SVANTAGGI:• Sensibilita’ (rischio di contaminazioni-falsi positivi)• Variabile efficienza di amplificazione a seconda della sequenza• Richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificare e messa a

punto per coppie di oligonucleotidi di innesco (primers)• Può sintetizzare frammenti relativamente corti• La sintesi è imprecisa e introduce errori nella sequenza (la Taq pol

non possiede attività 3’->5’ esonucleasica)

Esempi di utilizzo della PCR

• Su DNA:– segnalare la presenza o meno di sequenze specifiche (mutazioni,

inserzioni virali, micro-organismo patogeni) -> PCR DIAGNOSTICA

– Amplificare frammenti specifici da usare in seguito come sonde oppure da “clonare”

• Su RNA messaggero (RT-PCR):– segnalare la presenza di specifiche molecole di RNA (espressione

genica, presenza di RNA di micro-organismi infettivi)

– Amplificare frammenti specifici da usare in seguito come sonde oppure da “clonare” - isolare cDNA specifici per determinati geni.

Trascrittasi Inversa-PCR

• Rivelazione di mRNA molto rari• Analisi di RNA con pochissime

quantita’

Procedura• Purificazione dell’RNA• Aggiungere i primer• mescolare RNA con la trascrittasi

inversa per effettuare la sintesi del primo filamento di cDNA

• Aggiungere la DNA polimerasi termostabile per effettuare la sintesi del secondo filamento di cDNA e per amplificarlo con i cicli della PCR

AAAAA5’ TTTTTPrimer 1 3’ 5’

reverse transcriptase(RNA-dependent DNA polymerase)

AAAAATTTTT

mRNAcDNA

mRNA

Remove RNA(RNase A)

TTTTT 5´cDNA

Add PCR primers

Trascrittasi inversa - PCR (RT-PCR)

TTTTT5’3’

5’ 3’Primer 2Primer 3

5’3’ 5’

3’

3’

3’

Add Taq polymerase. Run PCR

RT-PCR semi-quantitativa:Selezione del numero di cicli

necessari per trovarsi nella fase di amplificazione esponenziale

Nu

mb

er

of

mo

lec

ule

s

Number of cycles

RT-PCR in tempo reale

• Utilizza particolari combinazioni di coloranti fluorescenti la cui fluorescenza viene smascherata quando la catena di DNA viene sintetizzata oppure che vengono intercalati nella catena nascente durante la reazione di amplificazione.

• L’utilizzo di appositi apparecchi permette la misurazione della fluorescenza accumulata in tempo reale, proporzionale al numero di molecole amplificate e quindi al numero di molecole presenti in partenza

Polymerase Chain Reaction: resa• Resa teorica: 2n

P=(2)n T Il prodotto (P) incrementa esponenzialmente con il numero di cicli di PCR (n)

Il prodotto di PCR dipende da T,numero di copie di template di partenza

Lo

g[D

NA

]

N° ciclitermici

EsponenzialeEsponenziale

LineareLinearePlateauPlateau

Prodotto Prodotto variabilevariabile

Perché Real-Time?

Misura l'amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l'efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione, permettendo di ottenere risultati molto più accurati rispetto alla PCR tradizionale "end point"

RT-PCR quantitativa

PlotPlot linearelineare

Incremento diIncremento difluorescenzafluorescenza

Cicli di PCR Cicli di PCR

•Rilevamento della fluorescenza associata all’amplificazioneRilevamento della fluorescenza associata all’amplificazione •Il prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosioIl prodotto di PCR non viene analizzato su gel di agarosio

•Analisi del prodotto di fluorescenza tramite computerAnalisi del prodotto di fluorescenza tramite computer

Analisi tramite software

•La fluorescenza si genera durante la PCR per

effetto di diverse possibili reazioni chimiche

•Le chimiche principali sono basate sia sul

legame di coloranti fluorescenti che si intercalano

nella doppia elica di DNA, come il SYBR Green,

sia sull'ibridazione di sonde specifiche.

Chimiche fluorescenti Chimiche fluorescenti per PCR Real-Timeper PCR Real-Time

SYBR Green ISYBR Green: principioUtilizza una molecolaUtilizza una molecola fluorescente non specifica che si fluorescente non specifica che si

lega al solco minore del DNAlega al solco minore del DNA

All’inizio del processo di amplificazione, la miscela di reazione contiene DNA denaturato, primers e la

molecola fluorescente

SYBR GreenSYBR Green

SYBR GreenSYBR GreenDopo l’annealing dei primers, si legano poche molecole fluorescenti alla doppia elica.

SYBR GreenSYBR GreenDurante l’elongazione si verifica un aumento di fluorescenza che corrisponde all’ aumento del numero di copie dell’amplicone

l l se r st l se r st pl

+ + + + - - - - RT

Reverse transcriptase-PCR (= RT-PCR)

Epoxide hydrolase

831947

19042027

564

1584

Ibridazione dell’RNA in situ

Rivelazione di mRNA direttamente su tessuti messi su vetrini da microscopio

Preparation of RNA probe with in vitro transcription

T7/T3 or SP6 promoter

Fig. 7. RNA in situ hybridization with antisense (a-c) and sense (d) RNA probes for ElLTP1. E. lagascae seedlings were collected 7 days after sowing. co Cotyledon, en endosperm, hy hypocotyl, am apical meristem, ro root

RNA in situ hybridization

Colour substrate:

nitro blue tetrazolium (NBT) + 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP)

• Il livello di RNA presente nella cellula non necessariamente riflette direttamente i livelli di trascrizione del gene

• Per poter asserire che un gene viene attivato TRASCRIZIONALMENTE occorre poterne visualizzare l’attivita’

Il saggio di “run-on” permette di determinare il livello di

trascrizione di un gene

1) Purificare i nuclei2) + NTP, 32P GTP3) Trascrizione: la catena nascente e’ radioattiva4) Estrazione dell’RNA5) Ibridazione a cDNA immobilizzato

su filtro

Sintesi differenziale di 12 geni codificanti mRNA epato-specifici analizzata tramite run-on

LodishFigure 10-23

Northern blottingProbe labeling

pBS-SemaIII

dATP

dGTPdTTP

dCTPRNA isolation

AAAAAA

Gel electophoresis

Blotting

Hybridization

Autoradiography

reverse Northern blotting

Down-regulation of transcripts

Up-regulation of transcripts

**

labeled (specific) probe

target

Northern

**

specific probes

labeled target

reverse Northern

cDNA arrays (continued)

• macro-arrays– low-density

– filter-supported

– radioactive probes (duplicates)

– low sensitivity

– only cDNA clones spotted

– cheap

cDNA arrays (continued)

• micro-arrays– high-density

– glass-supported

– fluorescent probes (single slide)

– high sensitivity

– ability to spot oligonucleotides

– very expensive

Tessuto della prostata, normale

Tessuto della prostata, tumorale

Un microarray è un supporto solido sul quale sono stati posizionati diverse migliaia di cDNA in spot separati. Ciascuno spot rappresenta un gene, in quanto contiene numerose copie di un cDNA corrispondente a tale gene.

I microarrays

In questo esempio i cDNA sono stati posizionati su di un vetrino, simile ai normali vetrini usati per l’istologia.

Microarray technology

http://www.ym.edu.tw/excellence/HBP/HBP_CP4/procedure.htm

Microarray synthetized by photolithography or EST/oligo “linking”

Probes

si confrontano i profili di espressione genica di due campioni differenti.E’ necessario estrarre le molecole di mRNA dai due campioni.

Tessuto della prostata, normale

Tessuto della prostata, tumorale utilizzo dei microarrays

ArraysProbe DNAs are “spotted” onto a glass slide

Each spot corresponds to a particular gene e.g. β-actin

Each array will have thousands of spots (typically 3000 to 30000)

TargetsRNA is extracted from tissues or cells

testreference

mRNA

cDNARNA is copied to DNA

labelled DNA is fluorescently labelled

pooled Samples are pooled

Hybridisation

Labelled target DNA hybridised to array

Fluorescence of each spot indicates how much of particular RNA was present in both samples

Data ProcessingHybridised Hybridised

ArrayArray

ImagesImages

Scanner

RatiosRatios

Spot-finding

Normalisation

Normalised Normalised RatiosRatios

Furtheranalysis

Cy5Cy5Cy3Cy3 Cy3 Cy5test reference

                                                                                          

Spot-finding (1)

Software identifies grid of spots and maps individual spot locations

Estrazione dell’mRNA dai 2 campioni di cellule che si vogliono confrontare

Conversione in cDNA

Marcatura con 2 fluorocromi diversi

Riconoscimento tra i cDNA

Eccitazione della fluorescenza tramite laser

Immagine a colori raffigurante il microarray

provenienti dai 2 campioni e quelli già presenti sul microarray

(1)

(2)

(3)

(4) (5)

(6)

Confronto dei profili di espressione genica in due campioni cellulari diversi

STUDIO DEI PROMOTORI: siti di legame dei fattoridi trascrizione

EMSA

Trans Factor Methods: EMSA

Trans Factor Methods: EMSA

Electromobility“Shift”

Trans Factor Methods: Consensus Sequence Capture

Il saggio EMSA identifica interazioni tra DNA e proteine

anticorpo

Il saggio EMSA identifica interazioni tra DNA e proteine

LodishFigure 10-7

• Competizione con stesso sito, sito analogo, sito mutato• Identificazione dei fattori coinvolti tramite “supershift” con anticorpi

Il footprint con DNasi I permette di localizzare il sito di interazione

tra proteina e DNA

LodishFigure 10-6