RUOLO DI ELEMENTI IN CIS NELLA REGOLAZIONE DELLO

SPLICING DI LSD1

Alessandro MADAIOMatricola: 749969

Relatrice: Elena BATTAGLIOLICorrelatrice: Leda PAGANINI

ANNO ACCADEMICO 2011/12

Lysine Specific Demethylases 1 (LSD1) demetila in modo specifico la Lisina 4 mono- o di-metilata dell’istone H3 (H3K4), agendo da

repressore trascrizionale

UBIQUITARIE

NEURONALI

Grado di conservazione dell’esone 8a nei mammiferi

788 bp

Sequenza complementare invertita: è conservata in tutti i mammiferi

D T V K

5’ – TTAAAAGGACACTGTCAAGGTATTTT…………TCCCTCTAACCTTGACAGTGTCCCTTTAA - 3’

Palindrome

SCOPO del LAVORO

• Determinare il ruolo della sequenza complementare invertita all’esone alternativo 8a nell’inclusione di quest’ultimo nel trascritto maturo di LSD1.

LA STRUTTURA SECONDARIA DELL’RNA INFLUENZA LO SPLICING

LSD1 wtΔG= -94.69 kcal/mol

LSD1 DeletoΔG= -70.27 kcal/mol

Palindrome

LA STRUTTURA SECONDARIA DELL’RNA INFLUENZA LO SPLICING

5’

5’

5’

3’

3’

3’

SCHEMA PER LA DELEZIONE

PRIMA PARTE

UP DOWN

SECONDA PARTE

VETTOREpBSplicing

DTVKE8 E9

Hind III Hind III

DIGESTIONE di CONTROLLO con HindIII

4550 bp

1200 bp1000 bp

470 bp400 bp

(*): sono presenti due bande sovrapposte da 1270 e1200 bp

**

PALINDROMEMG wt

MG Deleto

ANALISI TRASCRITTI

% inclusione E8a = X 100

Vettore pBSplicing MG wt MG deleto

-20%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0%

13%

87%

Hela

Vettore pBSplicing MG wt MG deleto

-20%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0% 0% 0%

HelaSY-5Y

CONCLUSIONI1. Il MG utilizzato è un ottimo sistema per lo studio dello splicing in vitro.2. Il frammento di LSD1 clonato contiene gli elementi in cis necessari a dirigere

in processamento in modo neuro-specifico.3. La palindrome svolge un importante ruolo di modulatore negativo per lo

splicing alternativo di LSD1, però la sua delezione non è sufficiente a garantire l’inclusione in cellule non neuronali come le Hela.

% in

clus

ione

E8a

SCOPO del LAVORO

• Determinare il ruolo della sequenza complementare invertita all’esone alternativo E8a nell’inclusione di quest’ultimo nel trascritto maturo di LSD1.

• Determinare l’azione del fattore di Splicing NOVA-1 in funzione della sequenza complementare ed invertita all’esone E8a.

0X 1X 2X 3X0%

5%

10%

15%

20%

25%

Nova vector : MG

perc

enta

ge o

f exo

n E8

a in

clusio

n in

MG

vect

or

EFFETTO POSITIVO DOSE DIPENDENTE DI NOVA-1

SY-5Y

AZIONE POSITIVA DI NOVA-1 è MEDIATA DALLA PRESENZA DELLA PALINDROME

Hela

+ NOVA-1 + NOVA-1+ NOVA-1+ NOVA-1

MG wt MG wtMG Deleto MG Deleto

% in

clus

ione

E8a

**

PROSPETTIVE FUTURE

• CREAZIONE DI UN COSTRUTTO IN CUI SIANO MUTATI CONTEMPORANEAMENTE PIU’ SITI DI LEGAME PER IL FATTORE DI SPLICING NOVA-1.

• INDIVIDUAZIONE DEL FATTORE DI SPLICING NECESSARIO E SUFFICIENTE A PERMETTERE L’INCLUSIONE DELL’ ESONE E8a ANCHE IN CELLULE NON NEURONALI.

Grazie per l’attenzione