Post on 18-Feb-2019
transcript
S. Del Vecchio
XII CONGRESSO NAZIONALE AIMN 2015
Rimini 16 - 19 aprile
Reversione del fenotipo glicolitico
mediante terapie a bersaglio molecolare
Dipartimento di Scienze Biomediche Avanzate Università degli Studi di Napoli Federico II
La glicolisi viene inibita in presenza di ossigeno che permetteai mitocondri di ossidare il piruvato a CO2 e H2O
Nei lieviti che sono organismi facoltativamente anaerobi il consumo di glucosio e’ ridotto in presenza di O2 (Effetto Pasteur)
Le cellule maligne derivate da tumori umani se messe in coltura in presenza di ossigeno mantengono il loro fenotipo di esaltata glicolisi
Glicolisi e respirazione cellulare sono vie alternative del consumo di glucosio nelle cellule normali
Ma non nelle cellule neoplastiche
Effetto Warburg o glicolisi aerobica
Le cellule tumorali hanno un elevato consumo di glucosio attraverso la glicolisi con conseguente produzione di acido lattico anche in presenza di ossigeno
Le cellule neoplastiche sono strettamente dipendenti dall’apporto esterno di glucosio perché il metabolismo energetico attraverso la glicolisi è altamente inefficiente (solo 2 molecole di ATP contro le 36 del ciclo di Krebs)
Il fenotipo glicolitico delle cellule tumorali non è adattativo ma costitutivo
L’attivazione di alcuni oncogeni, la perdita di funzione di alcunigeni oncosoppressori o la stabilizzazione costitutiva di HIFpossono causare:
una iperespressione di GLUT o una traslocazionedei GLUT sulla membrana plasmatica
una aumentata attività o espressione di enzimi glicoliticiin particolare delle esochinasi
oppure una riduzione della funzione mitocondriale e quindidella respirazione cellulare
Acquisizione del fenotipo glicolitico costitutivo
Cantor JR Cancer Discovery 2012,2:881
Red : oncogenes
Green :tumor suppressors
Glucose metabolism in cancer
La trasformazione neoplastica innescata da mutazioniattivanti del EGFR comporta, oltre che una proliferazionecellulare incontrollata, una riprogrammazione del metabolismo del glucosio
Vander Heiden MG et al., Science 324: 1029-1033, 2009
Metabolismo del glucosio e cancro
Ipotesi di lavoro
L’inibizione di EGFR mutato determina la reversione del fenotipo glicolitico e la riattivazione della respirazione ossidativanelle cellule trasformate
Glycolytic pathway
• GLUT1 and GLUT3• HK1 and HK2• PKM1 and PKM2• OXPHOS: subunits of mitochondrial
complexes (I-V)
Proteins of interest
Substrate
• Glucose• 18F-Fluorodeoxyglucose
Biochemical end points
• ATP• LactateATP
H1975 cells
kinasedomain
L858R(exon 21)
T790M(exon20)
EGFR
TKIs
Non-small cell lung cancer cell lines
T790M-mediatedresistance
H1993 cells
kinasedomain
EGFR
TKIs
MET
MET-mediatedresistance
Efficient and inefficient inhibition of EGFR signaling
H1975 WZ4002
H1993 MET-inhibitors: PHA 665,752crizotinib
Cell line Efficienttreatment
Inefficienttreatment
Erlotinib
Erlotinib
Sensitivity of NSCLC cells to WZ4002 and PHA-665,752
WZ4002 caused a concomitant decrease of p-EGFR, p-AKT, p-ERK and cyclin D1 levels
Erlotinib 1 µM WZ4002 0.1 µM
WZ4002 1 µM
p-ERK 1/2
EGFR
actin
p-AKT
Cyclin D1
p-EGFR
ERK 1/2
AKT
Erlotinib 1 µM PHA-665,752 1 µM
H1993- + - - - +
H1975
- + - - - - + - - - - +
MET
p-MET
In addition H1993 cells showed a p-MET and p-EGFR decrease after treated with PHA-665,772 and erlotinib, respectively
Levels of proteins involved in glycolysis in response to treatment
p-PKM2
HK 2
GLUT 1
GLUT 3
PKM1
PKM2
HK 1
actin
Erlotinib 1 µM WZ4002 0.1 µM
WZ4002 1 µM PHA-665,752 1 µM
48h
- + - - - - + - - - - +
H1975
- + -
- - +
H1993NT erlotinib WZ4002 0.1 µM WZ4002 1 µM PHA-665,772 1 µM
*
H1993H1975% 1
8F-F
DG
up
tak
e ov
er c
trl
*
0
20
40
60
80
100
120
140
Decrease after treatment with efficient inhibitors of expression of HK2 and phospho-PKM2 (Tyr 105)
0
50
100
150
200
250
300
350
H19750
100
200
300
400
500
600
H1993
µg
Glu
cose
/106
cel
ls
µg
Glu
cose
/106
cel
ls ******
**
***
18F-FDG uptake and residual glucose in media in untreated and treated cell lines
Expression of mitochondrial complexes and ATP/lactate ratio
H1975
- + - - - - + - - - - +
48 h
actin
- + -
- - +
H1993
strong up-regulation of several subunits
of mitochondrial complexes involved in oxidative phosphorylation after treatment with WZ4002 and PHA-665,752
inverse relationship between intracellular ATP and lactate levels in both cell lines
ATP
/lacta
te r
ati
o p
er
10
6 c
ells
H1975 H19930
0.20.40.60.81.01.21.41.61.8
**
****
**
NT erlotinib WZ4002 0.1 µM WZ4002 1 µM PHA-665,772 1 µM (ATP5A) V
(UQCRC2) III
(COXII) IV
(SDHB) II
(NDUFB8) I
Erlotinib 1 µM WZ4002 0.1 µM
WZ4002 1 µMPHA-665,752 1 µM
EGFR mutatodelezione esone 19 T790M
U0126
Wortmannin
PP
RAS
BRAF
MEK
ERK
PI3K
AKT
mTOR
Inibizione differenziale dei pathways a valle del recettore
EGFR mutatodelezione esone 19 T790M
U0126
Wortmannin
PP
RAS
BRAF
MEK
ERK
PI3K
AKT
mTOR
Inibizione differenziale dei pathways a valle del recettore
Cosa succede quando inibiamo EGFR
HKII
Glucosio
Glicolisi
PEPADP
ATP PKM2(alta attività)
Piruvato
OXPHOS
Biosintesi di macromolecole
Cellule tumorali
HKII
Glucosio
Glicolisi
PEPADP
ATPPKM2
fosforilazione in Tyr105(bassa attività)
Piruvato
Lattato
Biosintesi di macromolecole
OXPHOS
con EGFR attivoCellule tumorali con EGFR inibito
tumor growth (~0.8 cm)
basal: 18F-FDG PET/CT 3 days: 18F-FDG PET/CT
50 mg/kg/d p.o. for 3 days
H1975 & H1993 cells
s.c. injection of female BALB/c (nu/nu) mice
7.4 MBq of 18F-FDG through the tail vein and were subjected to microPET/CT 1 h post-injection
Animal tumor model
Ex vivo tumor analysis
Erlotinib, WZ4002, Crizotinib
18F-FDG PET/CT studies performed in nude mice bearing H1975 xenografts before and after 3 days of treatment
EGFR efficient inhibition
EGFR inefficient inhibition
Untreated
WZ4002 50 mg /kg
Untreated
Erlotinib 50 mg /kg
Glycolytic pathway and mitochondrial complexes expression in surgically removed H1975 and H1993 xenografts
H1975
Erlotinib 50 mg/kg WZ4002 50 mg/kg Crizotinib 50 mg/kg
- + - - - + - - -
actin
HK2
p-PKM2
PKM2
H1993
- + - - - - - - +
3 days
In agreement with in vitro findings, a dramatic reduction of HK2 and p-PKM2 levels was found along with a strong upregulation of mitochondrial complexes I-IV in samples from animals treated with WZ4002 and crizotinib
(ATP5A) V
(UQCRC2) III
(COXII) IV
(SDHB) II
(NDUFB8) I
SUVmax 4.2
SUVmax 6.3
FDG-PET/CT before and 1 week after erlotinib treatment in NSCLC
Baseline
1 week
University of Naples, Italy
FDG-PET/CT before and after erlotinib treatment in a non-responding metastatic lung cancer patient
Baseline 1 week
University of Naples, Italy
L’inibizione di EGFR mutato nel NSCLC determinauna reversione del fenotipo glicolitico e una riattivazione della respirazione ossidativa
Conclusioni
La riattivazione della respirazione ossidativa implicauna migliore risposta a chemio e radioterapia
18F-FDG can correctly detect T790M-mediated resistanceand its reversal by third generation TKIs early in the courseof treatment
18F-FDG cannot accurately detect MET-mediated resistance and its reversal by MET inhibitors early in the course of treatment
18F-FDG
Unchanged or increasing FDG uptake after therapy is a reliable and suitable index of non-response