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Antonio Novelli
Societa’ Italiana di Genetica Umana
Busto Arsizio, 11 maggio 2012
La SIGU ha obiettivi prevalentemente scientifici e si propone come struttura di riferimento e di consulenza per problemi di interesse scientifico e sanitario concernenti la Genetica Umana in tutti i suoi aspetti applicativi all'uomo. La SIGU intende collaborare con coloro che in Italia sono interessati alla ricerca e ad ogni tipo di approfondimento relativo alle discipline Genetica Medica e Genetica Umana, in particolare elaborando criteri di qualità per i l aboratori di Genetica Medica operanti nell'ambito delle strut turesanitarie pubbliche e private , contribuendo alla elaborazione di linee guida nell'ambito della ricerca Genetica Umana e promovuendo con ogni mezzo la pubblica consapevolezza sulle funzioni, le potenzialità ed i limiti delle tecniche diagnostiche di Genetica Umana.
Guidelines
7. QF-PCR FOR RAPID PRENATAL
DIAGNOSIS OF ANEUPLOIDY
This technique is a useful
adjunct to prenatal diagnosis
and is a more appropriate
technique than FISH when
dealing with large numbers of
prenatal referrals. Internal
validation is essential before
using this technique. Close
liaison with Molecular Genetics
colleagues is necessary to
establish this technique in a
cytogenetic laboratory.
The limitations of QF-PCR in
identifying chromosome
abnormalities must be clearly
known. It is recommended that
testing for trisomies 13, 18 and
21 is carried out, whilst it is
acceptable to test for sex
chromosome aneuploidy in only
a subset of referrals. QF-PCR
analysis provides information
only about the probe locus in
question. It does not substitute
for a complete chromosome
analysis.
EE(RI)(RI)VOLUZIONE DELLA CITOGENETICA:VOLUZIONE DELLA CITOGENETICA:DAL CROMOSOMA ALLDAL CROMOSOMA ALL’’ARRAYARRAY
10 Mb
VisioneVisionedd’’insiemeinsiemedelldell’’interointerogenoma, ma genoma, ma
bassabassarisoluzionerisoluzione
40-100Kb
AumentaAumenta la la risoluzionerisoluzione, , ma ma ll’’analisianalisi diventadiventa
locuslocus--specificaspecifica
ArrayArray--CGHCGH: AltaAlta risoluzione(10-12Kb) e analisidell’intero genoma in un unico esperimento
Chromosomal revolution400 550 800bande
different
cytogenetical
RESOLUTION
Investigations over the past four years clearly demonstrate that the
human genome harbors thousands of structural genomic variants. The
largest category of currently-known structural genomic variants are
copy number variants (CNVs), where segments of DNA sequences are
either lost or gained within individual genomes.
The existence of CNVs in healthy individuals has made it a
challenge to accurately interpret “pathogenic” CNVs detected
in genetic diagnostic testing
CNVs – Copy Number Variations
An ongoing “revolution”
2,6
milion
SNPs
arrays
Implication of this revolution
Over 100 new genetic syndromes
CNV:
Stevenson et al, Am J Med Genet 123A: 29-32, 2003
Exponential
increase of
genomic
diseases in
human
pathology
Koolen et al. 2008 HumMut
Recurrent reciprocal 16p11.2 deletion
and duplication syndrome
Genomic analysis -
Hard to interpret results
Variable espressivity : from normal to
developmental delay and autism.
It is not possible to predict the phenotype
Which indications?
Real cost/benefit?
Which kind of array?
PD indications
EMA (≥ 35 years)
Previuos pregnancy with
chromosomal anomaly
Parent carrier of a chromosomal
rearrangement
Familiar hystory of chromosomal
anomaly
Abnormal ultratounds
Positive biochemical screenings
Familiar hystory for neural tube
defects
Parent(s) carrier (s) of a
mendelian condition
““anan inevitableinevitable questionquestion …”…” (actually, more than one!)
Targeted array
Whole-genome array (Oligo)
Considerazioni
• il dubbio-domanda-preoccupazione se gli strumenti che la citogenetica tradizionale codifica per la formulazione del cariotipo siano realmente oggettivi rispetto alla realtà tecnologica.
• se la diagnosi cromosomica offerta quotidianamente regge lo scontro coi propri limiti sempre più spesso portati alla verifica di tecniche genomiche precise (array-CGH).
• Se forse non sia ora di attuare un salto verso l'automazione di alcune tecniche che alzino il livello di precisione della citogenetica.
•....gli arrays servono a verificare la qualità del lavoro citogenetico ?
•... si vuole sostituire la citogenetica con gli arrays..e/o tecniche molecolari?.
•Queste nuove piattaforme tecnologiche sono sufficienti ad individuare le anomalie cromosomiche?
•. necessità che il gruppo di citogenetica si esprima t empestivamente su questo argomento nell'attesa di un consenso general e le linee guida
specifiche e condivise
non certo come strumento di concorrenza
Considerazioni……… .
Domande?� Quali patologie analizzare – Come stabilire che una
patologia è grave o meno grave?
� Si deve comunicare il risultato che uno screening genomico
rivela al di fuori della specifica patologia richiesta – informed
consent or generic genetic consent? Elias S, Annas GJ. NEJM 1994
� In assenza di linee guida chiare non si rischia che sia il
mercato a scegliere – chi direbbe no?
� Questa DP è economicamente sostenibile o rischia di
creare una discriminazione tra le coppie?
L'uso del termine cariotipo molecolare per intendere l'analisi array-CGH può indurre (più o meno innocentemente) l'utente a pensare che altro non trattasi che di miglior tecnica in un unico percorso metodologico, come dal Giemsa alle bande, e di conseguenza a pensare che chi lo applica sempre è bravo e gli altri no.
L'innocenza scompare quando ci accorgiamo che gli arraysvengono eseguiti e gli esiti comunicati senza l'analisi cromosomica e ad un prezzo surrogato, ……
è evidente che l'offerta è alternativa
il CARIOTIPO non è tradizionale, e neppure molecolare. …………………...
The Karyotype is the number and the appearence of the chromosomes in the nucleus of an eukaryotic
cell...Karyotypes describe the number of chromosomesand what they look like under a light
microscope..(Wikipedia).
Analisi dello stesso campione in altro centro, non conferma il dato
• dalla necessità di rispondere il prima possibile ad un paper di un gruppo Italiano ed a una copertina di Prenatal Diagnosis che raccomandano l'utilizzo degli aCGH come test di primo livello, cosa che ogni genetista, oggi non puo' accettare.
• e soprattutto quello che sta accadendo: si manda in giro una pubblicazione che asserisce la "morte del cariotipo" e la sua sostituzione con un CGH array a tutto spiano per risolvere tutti i problemi a costi bassissimi,con la conseguenza che con risultati spesso dubbi, la gestante viene presa in carico per la consulenza genetica da centri di riferimento regionali
•OBJECTIVES: At present, a precise guideline establishing chromosomemicroarray analysis (CMA) applications and platforms in the prenatal setting does not exist. The actual controversialquestion is whether CMA technologies can or should shortlyreplace the standard karyotype in prenatal diagnosispractice
• CONCLUSIONS: Presently CMA analysis can be considered a second-tierdiagnostic test to be used after a standard karyotype in selected group of pregnancies, such as those with single (apparently isolated) or multiple US fetal abnormalities, with de novo chromosomal rearrangements, even ifapparently balanced, and those with supernumerarymarker chromosomes.
Karyotype on amniotic fluid:
46,XY,t(4;11)(q25;p15)
chr (4)der (4) chr (11)der (11)
Post-natal genetic counselling →
RIEGER Syndrome - PITX2 (4q25)
AD include several congenital malformations of the eye anterior segment
Array-CGH con risoluzione di 200 Kb → NEGATIVA
Rottura del gene PITX2 (RP11-380D23)
APLOINSUFFICIENZA di PITX2
RP11-380D23
CEP 4
Analisi dei punti di rottura sul cromosoma 4 con sonda
locus-specifica
RP11-380D23 (PITX2)PITX2
der (4)
der (11)
chr (4)
46, XX, t(15;17)(q14;p13.2)
WCP 17
WCP 15
15p11.2 D15Z1
15q11-q13 / 15q22 PML
17p11.2 SMS (RAI1)
17p13.3 MDS (LIS1)
Chr:17
Chr:15
Array-CGH piattaforma Oligo 2x105K
Hg:18
_ Nata a termine_ Misurazioni nella norma_ Buone condizioni generali_ Ecocardiografia, Ecografia renale, Ecografia cerebralenella norma_ Difetto isolato bilaterale arti superiori: Pollice digitalizzato (ad impianto prossimale, trifalangeo)
RP11-1D5 (17p13.1) RP11-78N21 (17p13.1)
Break Point
RP11-483E23 (15q13.1)
HYPOTHESIS:
1) interruption of a gene in one of the translocation breakpoints
2) Positional effect on genes neighbouring the breakpoint or translocated to a different locus.
PATHOLOGICAL REARRANGEMENT NOT ASSOCIATED TO THE PH ENOTYPE
RIS ORIGINE Mb START END
dup 16p13.12-p13.11 pat 1,5 14,687,665 16,218,541
dup 15q13.2-q13.3 mat 1,7 28,801,829 30,494,145
Variable phenotype with incomplete penetrance
21 weeks of pregnancy: 46,XXUltrasound: complex heart defect (troncoconal malformation)Counselling: ? Normal variat or susceptibility locus?
Termination of pregnancy for fetal malformationexcess of information50% recurrence risk in future pregnancies?
Locus associated to susceptibility to autismand to mental retardation
Locus associated to susceptibility to schyzophrenia
PATHOLOGICAL REARRANGEMENT NOT ASSOCIATED TO THE PH ENOTYPE
RIS ORIGINE Mb START END
dup 16p13.12-p13.11 pat 1,5 14,687,665 16,218,541
dup 15q13.2-q13.3 mat 1,7 28,801,829 30,494,145
20 SG: 46,XYUltrasound: increased NT Counselling:? Normal variat or susceptibility locus?
Not requested information about maternal genome: What does it involve? Eventually late onset...
Variable phenotype with incomplete penetrance
The analysis detected two rearrangements:
A 1,2Mb microduplication, in 4p15.31, paternally inherited
A 86,8Kb microdeetion, in 2p16.3, maternally inherited
+
=
?
46,XY,t(1;2)(p22;q13)dn
aCGH: detection of cryptic imbalances not visible by standard cytogenetics techniques
� Amniotic fluid
� Normal parental karyotype
WCP1
WCP2
WCP1
WCP2
WCP1
WCP2
� Empiric risk of develompental anomalies: 6%
� alla nascita: ritardo di crescita, dismorfismi
a
b
c
a) 2 microdeletions on chromosome 1 havebeen detected.
b) partial deletion of region 1p32p31.3(~3 Mb)
c) partial deletion of region 1q23.3(~1,9 Mb)
.
aCGH: detection of cryptic imbalances not visible by standard cytogenetics techniques
Oligo 4x44K del 2q37.1-q37.3 dn 7.6 Mb 235164577.5 242717042.5
RP11-655C18 (16q24.1-q24.2)
Oligo4x180K
del 16q24.1-q24.2 dn 1,9 Mb 85,009,312 86,911,88
9
Gene FOXC2; Yu et al 2010 idronefrosi congenita
19 S.G. Amnio: 46,XYEcografia:igroma cistico,onfalocele,idronefrosi
IUGR
Complex heart defect(Shone’s anomaly)
Minor skeletalanomalies
Radio FC, Bernardini L, Loddo S, Bottillo I, Novelli A , Mingarelli R, Dallapiccola B.“TBX2 gene duplicati on associated with complex heart defect and skeletal malformations mimicking animal models with Tbx2 null phenotype” Am J Med Genet 2010
Elevata risoluzione del microarray � CNVs “monogeniche”
Array-CGH con risoluzione di circa 200 Kb : NEGATIVA
arr dup(17)(q23.2q23.2)
Elevata risoluzione del microarray � CNVs “monogeniche”
Radio FC, Bernardini L, Loddo S, Bottillo I, Novelli A , Mingarelli R, Dallapiccola B.“TBX2 gene duplicati on associated with complex heart defect and skeletal malformations mimicking animal models with Tbx2 null phenotype” Am J Med Genet 2010
Analisi di SNP-array con risoluzione di 75 Kb (Affymetrix 6.0 Chip) � POSITIVA
TBX2: uno dei membri dei fattori di trascrizione della famiglia T-box. Modelli animali hanno dimostrato l’importanza di Tbx2 nello sviluppo del cuore, degli arti e della retina. In particolare, a livello cardiaco, Tbx2 interagisce con altri fattori di trascrizione nella formazione del canale atrioventricolare e nello sviluppo del tratto di efflusso.
III CASO. Elevata risoluzione del microarray � CNVs “monogeniche”
Le concentrazioni relative dei fattori di trascrizione sono cruciali per il corretto controllo della trascrizione durante lo sviluppo
Primo caso di duplicazione nell’uomo.Il topo knockout presenta cardiopatia e una delezione recentemente descritta 17q23.1q23.2 (Ballifet al., 2010) che include i geni TBX2 e TBX4 presenta un fenotipo parzialmente sovrapponibile � IPOTESI ����Delezione e duplicazione dello stesso gene èresponsabile delle stesse malformazioni congenite
Radio FC, Bernardini L, Loddo S, Bottillo I, Novelli A , Mingarelli R, Dallapiccola B.“TBX2 gene duplicati on associated with complex heart defect and skeletal malformations mimicking animal models with Tbx2 null phenotype” Am J Med Genet 2010
→ c'è bisogno di ulteriori studi prospettici con ampie coorti studiate con KHR e CGH (perchè intervallo di confidenza troppo ampio, non abbiamo ancora una stima precisa di quello a cui andiamo incontro,)
→ la risoluzione ottimale ancora non è stata determinata (in futuro useremo targeted array per screening per evitare CNV di significato incerto? )
→ trovare CNV di significato incerto ha una ricaduta immediata sulla consulenza genetica, con un aumento dei costi assoluti della diagnosi prenatale.
Take Home Message
Un analisi genetica
deve essere
INTEGRATA in una
consulenza
genetica
e NON essere un
test di laboratorio
Quality self-assessment in provision of genetic
counselingEurogentest WP3, 2008
Dimensioni e collaborazioni all’interno dell’Unità
massa critica (almeno 2 specialisti); revisione temporalizzata della casistica clinica; supervisione
da parte del responsabile; multidisciplinarità.
Aggiornamento dello staff
aggiornamento continuo interno e esterno; tempo adeguato per l’auto-educazione.
Ambienti e accesso
riservatezza nei locali della consulenza; facile accesso; conoscenza del servizio da parte del
pubblico; disponibilità della consulenze anche con telefono, telemedicina, ecc.; assistenza ai
bambini durante la consulenza.
Tempi di attesa
conoscenza degli utenti dei tempi di attesa; capacità di
gestire le urgenze.
Attività precedenti la consulenza genetica
studio del caso prima della consulenza; acquisizione di
informazioni compresa la storia familiare.
conclusioni• Un test di laboratorio deve essere sottoposto ad
una valutazione clinica prima di venire trasferito nella pratica.
• ogni test medico viene definito in base ad alcune caratteristiche, tra le quali sensibilità, specificità, valore predittivo positivo e negativo.-
• non esiste un test migliore: esiste il test appropriato per la specifica condizione clinica, discussa dal paziente e dal medico nell’ambito di ogni singola e specifica situazione.
• Nel caso dei test genetici la consulenza genetica deve essere inserita nel percorso diagnostico.
Grazie !