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Prof. Antonio Lavecchia

SPETTROMETRIA DI MASSA

Spettrometria di Massa

•  E’ una tecnica analitica che permette di determinare: –  la formula molecolare

–  la massa delle sostanze, misurando il rapporto massa/carica (m/z) dei corrispondenti ioni gassosi

Spettrometria di Massa •  La spettrometria di massa si basa sulla:

–  Ionizzazione

–  Frammentazione

Spettrometria di Massa •  La spettrometria di massa si basa sulla:

–  Separazione degli ioni

Spettro di Massa EI della Benzammide

ione molecolare

M m/z 121

-C6H5.

m/z 105 m/z 77

m/z 44

Spettro di Massa In

ità re

Massa, come m/z. Z è la carica, e per ioni con doppia carica positiva (come spesso accade nelle macromolecole), le masse si presentano con un valore metà di quello reale

massa crescente

Di solito non scansito al di sotto di m/z=32

M•+ (Impatto elettronico) “ione molecolare”

Distanza per unità di massa

Frammenti Ionici

provengono dallo ione molecolare o da frammenti di peso maggiore

Ionizzazione-frammentazione •  Es.: normal decano

sono allontanate dalla pompa da

sono accelerate e convogliate

all’analizzatore

Ionizzazione-frammentazione •  Es.: normal decano

•  Le particelle cariche, nello spettro, appaiono in corrispondenza del loro rapporto m/z

Entrata del campione

Il riscaldatore vaporizza il campione

Sorgente elettronica

Zona di ionizzazione

Il campo elettrico accelera le particelle verso la regione magnetica

Campo magnetico

Fascio ionico

Il campo magnetico separa le particelle secondo il loro rapporto m/z

Detector Particelle più leggere nel campione

Particelle più pesanti nel campione

Spettrometro di Massa

I Componenti dello Spettrometro

Spettro

Sorgente ionica

genera ioni gassosi

Sistema di iniezione

dove viene introdotto il campione da analizzare

Analizzatore

separa gli ioni in base al

rapporto m/z

Detector

converte l’energia ionica in quella elettrica

Calcolatore

archivia ed analizza i dati

–  magnetico

–  a quadrupolo

–  a trappola ionica (ion-trap)

–  TOF (Time of Flight - tempo di volo)

–  EI (Electron Ionization )

–  CI (Chemical Ionization )

–  ESI (Electro Spray Ionization)

–  MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization)

Sorgente Analizzatore

I Componenti dello Spettrometro

Sorgente e Meccanismi di Ionizzazione

•  Ionizzazione elettronica

•  Cattura di elettroni:

•  Protonazione

•  Deprotonazione

e- + M → M+• + e- + e-

70 eV ≈55 eV 0.1 eV

e- + M → M-• + e-

GH+ + M → [MH]+ + G

GH- + M → [MH]- + G

Ionizzazione Chimica (CI) –  molecola da analizzare (M) allo stato gassoso

–  gas reagente (GH) in concentrazioni relativamente elevate (1 a 100)

•  Il gas reagente è soggetto a ionizzazione elettronica EI

GH → G+.

•  Lo ione radicalico del gas reagente G+. reagisce con molecole GH neutre e forma ioni GH+

G+. + GH → GH+

GH+ + M → [MH]+ + G

Ionizzazione del Gas Reagente •  Esempio gas reagente: metano

CH5+ + M → CH4 + MH+

MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption lonization)

Irradiazione

Desorbimento

Trasferimento Protonico

ionizzazione

Matrice

Campione

Le molecole del campione vengono ionizzate per trasferimento protonico dalla matrice

•  Esistono numerose matrici, la cui scelta solitamente dipende dalla classe chimica del campione

•  Tra le più comuni si possono citare: –  acido sinapinico

–  acido α-ciano-4-idrossicinnamico

•  utilizzati prevalentemente per l’analisi di proteine e peptidi

–  acido 3-idrossi-picolinico

•  per oligonucleotidi

–  acido 2,5-diidrossibenzoico

•  per molecole organiche

ESI (Electro Spray lonization)

Guaina di N2

Sonda riscaldata ESI

Ago ESI

Pennacchio di ioni

±5 kV

Gas di nebulizzazione

ESI (Electro Spray lonization)

Goccioline contenenti ioni

Capillare ±5 kV

Col procedere dell’evaporazione delle

goccioline, il campo aumenta e gli ioni si muovono verso la

superficie

La densità di carica aumenta finchè

diventa così alta da determinare

l’espulsione di ioni di soluto dalla

gocciolina

Regola dell’Azoto

PM = 93

PM = 138

NH2 O2N PM = 183

NH2 O2N

Molecole contenenti un numero dispari di atomi d’azoto hanno una massa molecolare dispari, mentre composti

privi di atomi d’azoto o contenenti un numero pari di tali atomi, avranno un peso molecolare pari

Isotopi e Massa

•  Poiché la massa di un atomo è sostanzialmente dovuta alla somma dei neutroni e dei positroni, isotopi diversi hanno masse diverse

Isotopi e Intensità dei Picchi Isotopici

•  I diversi isotopi naturali sono presenti in abbondanza (cioè percentuale relativa) diversa

•  Di questi di solito il più leggero è il più abbondante

3H è radioattivo e decade molto velocemente

Masse Esatte e Abbondanze Isotopiche Naturali degli Elementi più Comuni

Elemento Simbolo Massa Esatta (u) Abondanza Rel. %

Idrogeno 1H 1.007825037 100.0

Deuterio 2H or D 2.014101787 0.015

Carbonio 12 12C 12.00000 100.0

Carbonio 13 13C 13.003354 1.11223

Azoto 14 14N 14.003074 100.0

Azoto 15 15N 15.00011 0.36734

Ossigeno 16 16O 15.99491464 100.0

Ossigeno 17 17O 16.9991306 0.03809

Ossigeno 18 18O 17.99915939 0.20048

Fluoro 19F 18.998405 100.0

Sodio 23Na 22.9897697 100.0

Fosforo 31P 30.9737634 100.0

Zolfo 32 32S 31.972074 100.0

Zolfo 33 33S 32.9707 0.78931

Zolfo 34 34S 33.96938 4.43065

Zolfo 36 36S 35.96676 0.02105

Cloro 35 35Cl 34.968854 100.0

Cloro 37 37Cl 36.965896 31.97836

Bromo 79Br 78.9183 100.0

Bromo 81Br 80.9163 98.0

Picchi Isotopici (M+1)

•  Per tre elementi –  C

–  H

–  N

•  il principale isotopo pesante (meno abbondante) è quello la cui massa è superiore di una unità a quella dell’isotopo più comune

Idrogeno 1H 1.007825037 100.0

Deuterio 2H or D 2.014101787 0.015

Carbonio 12 12C 12.00000 100.0

Carbonio 13 13C 13.003354 1.11223

Azoto 14 14N 14.003074 100.0

Azoto 15 15N 15.00011 0.36734

Ossigeno 16 16O 15.99491464 100.0

Ossigeno 17 17O 16.9991306 0.03809

Ossigeno 18 18O 17.99915939 0.20048

Fluoro 19F 18.998405 100.0

Sodio 23Na 22.9897697 100.0

Fosforo 31P 30.9737634 100.0

Zolfo 32 32S 31.972074 100.0

Zolfo 33 33S 32.9707 0.78931

Zolfo 34 34S 33.96938 4.43065

Zolfo 36 36S 35.96676 0.02105

Cloro 35 35Cl 34.968854 100.0

Cloro 37 37Cl 36.965896 31.97836

Bromo 79Br 78.9183 100.0

Bromo 81Br 80.9163 98.0

leggero pesante

Picchi Isotopici (M+1)

•  La probabilità di trovare un 13C nella molecola aumenta con il numero di carboni in essa contenuti e lo stesso fa l’intensità del picco isotopico M+1

•  Per l’azoto vale lo stesso ragionamento

Massa dei Picchi Isotopici Es. metano CH4

Picco dello ione molecolare accompagnato dal picco isotopico M+1

•  Il metano è una miscela di 2 composti: –  12CH4 che ha massa 16; picco a m/z 16 M+. 100 %

–  13CH4 che ha massa 17; picco a m/z 17 M+1 1.1%

Intensità dei Picchi Isotopici •  Esempio: naftalina naturale

•  E’ una miscela contenente: –  12C10H8: massa 128 M+. 100 %

–  13C 12C9H8: massa 129 M+1 11 %

Formula: C10H8

M+1 = 1.1 x 10 = 11 %

Picchi Isotopici (M+2) degli Elementi più Significativi

•  Nel caso di –  Ossigeno

–  Zolfo

–  Cloro

–  Bromo

•  il principale isotopo più pesante (meno abbondante) è quello la cui massa è superiore di due unità a quella dell’isotopo più comune

•  La presenza di questi elementi è rivelata dai picchi isotopici a M+2

Idrogeno 1H 1.007825037 100.0

Deuterio 2H or D 2.014101787 0.015

Carbonio 12 12C 12.00000 100.0

Carbonio 13 13C 13.003354 1.11223

Azoto 14 14N 14.003074 100.0

Azoto 15 15N 15.00011 0.36734

Ossigeno 16 16O 15.99491464 100.0

Ossigeno 17 17O 16.9991306 0.03809

Ossigeno 18 18O 17.99915939 0.20048

Fluoro 19F 18.998405 100.0

Sodio 23Na 22.9897697 100.0

Fosforo 31P 30.9737634 100.0

Zolfo 32 32S 31.972074 100.0

Zolfo 33 33S 32.9707 0.78931

Zolfo 34 34S 33.96938 4.43065

Cloro 35 35Cl 34.968854 100.0

Cloro 37 37Cl 36.965896 31.97836

Bromo 79Br 78.9183 100.0

Bromo 81Br 80.9163 98.0

leggero

pesante

•  Se nella molecola sono presenti solo C, H, N, O, F, P, I, le intensità percentuali approssimative attese per M+1 ed M+2 possono essere calcolate usando le seguenti formule:

Formula Semplificata per il Calcolo Approssimato dell’Intensità dei Picchi Isotopici

•  Esempio

M+1 = 1.1 x 10 = 11 % m/z 181

Formula: C10H12O3 PM = 180

M+2 = [(1.1 x 10)2 / 200] + (0.2 x 3) = 1.1 % m/z 182

M+1 = 11%

M+2 = 1.1% Formula: C10H12O3 PM = 180

Metodo dell’Abbondanza Isotopica

–  Il Cloro in natura si trova come 35Cl (100%) e 37Cl (33%) in rapporto 3:1

Cloro •  L'intensità relativa dei multipletti dovuti agli isotopi del

cloro si ottiene dallo sviluppo del binomio:

(a+b)n

a = abbondanza relativa dell’isotopo 35Cl (~ 100%)

b = abbondanza relativa dell’isotopo 37Cl (~ 33%)

n = numero degli atomi di Cl nel composto

−  n = 1 (0,75 + 0,25)1 = 3:1

−  n = 2 (0,75 + 0,25)2 = 9:6:1

−  n = 3 (0,75 + 0,25)3 = 27:27:9:1

−  n = 4 (0,75 + 0,25)4 = 81:108:54:12:1

H 2 C C H C l

−  n = 1 (0,75 + 0,25)1 = 3:1

150 100 50

−  n = 2 (0,75 + 0,25)2 = 9:6:1

120 118

m/z 50

C H C l 3

−  n = 3 (0,75 + 0,25)3 = 27:27:9:1

C C l 4

150 100

m/z 50

119 117 121

158 160

−  n = 4 (0,75 + 0,25)4 = 81:108:54:12:1

Metodo dell’Abbondanza Isotopica •  Il Bromo in natura si trova come 79Br (100%) e 81Br (97%):

rapporto 1:1

Bromo •  L'intensità dei multipletti dovuti agli isotopi del bromo si

ottiene dallo sviluppo del binomio:

(c+d)n

c = abbondanza relativa dell’isotopo 79Br (~ 100%)

d = abbondanza relativa dell’isotopo 81Br (~ 97%)

n = numero degli atomi di Br nel composto

−  n = 1 (0,5 + 0,5)1 = 1:1

−  n = 2 (0,5 + 0,5)2 = 1:2:1

−  n = 3 (0,5 + 0,5)3 = 1:3:3:1

−  n = 4 (0,5 + 0,5)4 = 1:4:4:6:1

108 106

H 2 C C H Br

20 100 60

−  n = 1 (0,5 + 0,5)1 = 1:1

157 155

250 200 150

−  n = 2 (0,5 + 0,5)2 = 1:2:1

150 200 250

250 252 254

C H B r 3

−  n = 3 (0,5 + 0,5)3 = 1:3:3:1

Grado di Insaturazione

•  Nel caso di C9H8N2O: ( ) ( )

28-2292I =

( ) ( )2

XNH-2NC2GI

Grado di Insaturazione

–  con GI = 2:

•  I seguenti gruppi funzionali contribuiscono: –  con GI = 1:

•  Il GI di benzene, naftalene e difenilmetano è, rispettivamente di 4, 7 e 8

Scissioni Primarie •  La scissione di un legame sullo ione molecolare può

essere –  omolitica, se si ha una equipartizione degli elettroni tra i due

–  eterolitica se gli elettroni sono trattenuti da uno solo degli atomi

Frammentazioni Primarie •  Avvengono direttamente sullo ione molecolare:

–  con perdita di un radicale (a numero dispari di elettroni) e formazione di un frammento cationico a numero pari di elettroni

Frammentazioni Primarie •  Avvengono direttamente sullo ione molecolare:

–  con perdita di una molecola neutra e formazione di un radicale catione a numero dispari di elettroni

Frammentazioni Secondarie

•  Gli ioni generati dalle frammentazioni primarie possono ancora contenere un eccesso di energia e subire a loro volta processi di frammentazione:

acetilene

OSSIGENO M-18 : perdita di . H2O M-28 : perdita di . CO M-31 : perdita di . OCH3 M-45 : perdita di . COOH M-59 : perdita di . COOCH3

M-27 : perdita di HCN M-16 : perdita di . NH2 (ammidi)

Frammenti Caratteristici

14 CH2 15 CH3 16 O 17 NH3, OH 18 H2O, NH4 19 F 26 CN, C2H2 27 C2H3 28 C2H4, CO 29 C2H5, CHO 30 CH2NH2 31 CH2OH 32 O2 33 SH 34 H2S 35 Cl 36 HCl 39 C3H3 41 C3H5 42 C3H6, C2H2O 43 C3H7, CH3C=O 44 CH2CHO 45 CH3CHOH, CH2CH2OH, CH2OCH2 46 NO2 47 CH2SH

48 CH3S + H 49 CH2Cl 51 CHF2, C3H3 53 C4H5 54 CH2CH2CN 55 C4H7 56 C4H8 57 C4H9, C2H5C=O 58 CH3C(=O)CH2 + H, C2H5CHNH2 59 C3H6OH, CH2OC2H5 60 CH3COOH 65 C5H5 66 C5H6 67 C5H7 68 CH2CH2CH2CN 69 C5H9, CF3 70 C5H10 71 C5H11, C3H7C=O 76 C6H4 77 C6H5 78 C6H5 + H 79 C6H5 + 2H, Br 91 C7H7

Elenco dei Frammenti Ionici Più Comuni

17 HO• 18 H2O 19 F• 20 HF 26 CHCH, •CN 27 CH2=CH•, HCN 28 CH2=CH2, CO 29 •CH2CH3, •CHO 30 NH2CH2•, CH2O, NO, C2H6 31 •OCH3, •CH2OH, CH2NH2 32 CH3OH, S 33 HS•, (•CH3 + H2O) 34 H2S 35 Cl• 36 HCl, 2 H2O 37 H2Cl 38 C3H2, C2N, F2 39 C3H3, HC2N 40 CH3CCH 41 CH2=CHCH2• 42 CH2=CHCH3, CH2=C=O 43 C3H7, CH3C•=O

44 CH2=CHOH, CO2, N2O, CONH2 45 CH3CHOH, CH3CH2O•, CO2H, CH3CH2NH2 46 (H2O + CH2=CH2), CH3CH2OH 47 CH3S• 48 CH3SH 49 •CH2Cl 52 C4H4 53 C4H5 54 CH2=CH-CH-CH2 55 CH2=CHCHCH3 56 CH2=CHCH2CH3 57 C4H9•, C2H5CO 60 C3H7OH 63 •CH2CH2Cl 71 C5H11• 73 CH3CH2OC(=O)• 74 C4H9OH 75 C6H3 76 C6H4 77 C6H5 78 C6H6

Elenco dei Frammenti Neutri Più Comuni

Frammentazioni Alcani

propano picco più intenso

ha un’intensità del 5.6%

più stabile

catione radicalico

Spettro di Massa del n-Esano

ione molecolare

picco base

Spettro di Massa del Neopentano

ione molecolare

picco base

[CH3-C=CH2]+. [CH3-CH2]+.

Frammentazioni Alcheni

carbocationi allilici

catione radicalico

+ + + C H C H 2 C H 2 C H 2 C H C H 2 C H C H 2 C H 2

Spettro di Massa dell’1-Butene

1-Butene

Picco molecolare M●+ = m/z 56 Carbocatione allilico m/z 41

CH2=C=CH+ cumulene

[ C H 2 = C H C H 2 C H 2 ] C H 2 = C H C H 2 + + • C H 3

Frammentazioni dei Cicloalcheni

alchene

1,3-diene catione radicale

alchene catione radicale 1,3-diene

Frammentazioni dei Cicloalcheni

A radical cation (m/z 68)

CH3C CH2C CH2H3C

Limonene(m/z 136)

A neutral diene(m/z 68)

Frammentazioni Alchini

Spettro di Massa dell’1-Pentino

dove: Z = N, O o S R può essere anche H

carbocationi

catione radicalico

Frammentazioni ammine, alcoli, tioli

Ø  propilammina (mol wt 59)

Ø  n-propanolo (mol wt 60)

Ø  propantiolo (mol wt 76)

Ø  3-amminopropanolo (mol wt 75)

ione "immonio"

+ + C H 2 C H 3 C H 2 N H 2

+ C H 2 C H 3 C H 2 N H 2 . .

+ + C H 2 C H 3 C H 2 O H

+ C H 2 C H 3 C H 2 O H

ione "ossonio"

+ C H 2 C H 3 C H 2 S H +

C H 2 C H 3 C H 2 S H

ione "solfonio"

C H 2 O H C H 2 C H 2 N H 2

C H 2 O H C H 2 C H 2 N H 2 m/z 31

C H 2 N H 2 C H 2 C H 2 O H m/z 30

Frammentazioni ammine, alcoli, tioli

m/z 47

m/z 30

m/z 31

Frammentazioni degli Alcoli

Spettro di Massa dell’1-Butanolo

amu = 31

heterolytic

amu = 56

Spettro del 3-metil-1-butanolo

m/z 88

Frammentazione di Ammine

m/z 30

++•β-cleavage

CH3 CH3CH3-CH-CH2-CH2-NH2 CH3-CH-CH2 CH2=NH2

ione "immonio"

isopentilammina

Frammentazioni Aldeidi o Chetoni

oppure Ione acilio

catione radicalico

Ione acilio

catione radicalico

10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000

Frammentazioni Chetoni 3-pentanone C5H10O, PM = 86

Riarrangiamento di McLafferty

dove: Y = R, H, OR, OH, etc.

Spettro del 2-ottanone che Mostra sia l’α scissione che il Riarrangiamento di McLafferty

CH3CO+ proveniente dall’α-scissione

CH3CH2CH2CH2CH2CH2CO+ proveniente dall’α-scissione

Ione molecolare m/z 128

m/z 58

Frammentazione di Acidi Carbossilici

•  Possono frammentarsi attraverso: -  una α-scissione con perdita del radicale alcossi e formazione dello

ione acilio

-  una α-scissione del gruppo carbossilico con perdita di radicali alchilici e formazione dello ione [COOH]+ a m/z 45

-  un riarrangiamento di McLafferty

Spettro dell’Acido Butirrico

+O≡COH

C4H8O2

Perdita di metile (-15)

amu = 60

OHamu = 45

Frammentazione di Esteri e Ammidi

•  Le più comuni frammentazioni osservate sono: -  il riarrangiamento di McLafferty

-  l’α-scissione al C=O con quattro diversi ioni risultanti:

RH- RCH=CH2

m/z 74

R C O+

importante negli esteri a catena corta

picco facilmente riconoscibile per gli esteri

picchi meno importanti

Spettro del Metil Butanoato

•+•+ m/z 71

m/z 59

Molecular ionm/z 102

α-cleavage

m/z 74

McLaffertyrearrangement +

+• +•O

•+•+ m/z 71

m/z 59

α-cleavage

m/z 74

McLaffertyrearrangement +

+• +•O

CH3-CH2-CH2+

Frammentazioni Sistemi Aromatici

ione tropilio

Frammentazione degli Idrocarburi Aromatici

+•+ Tropylium cation

(m/z 91)

Toluene radical cation

Toluene

Frammentazione degli Idrocarburi Aromatici

Benzil bromuro

pattern Bromo

ione Tropilio

Frammentazioni Sistemi Aromatici

Esempio: 1-fenilpentano (mol wt = 148) serie di frammenti carichi: 51, 63, 77, 91, 105, 119, 133 serie di frammenti neutri: (26),(14), 71, 57, 43, 29, 15

m/z 51

m/z 63 -

C 4 H 3 +

C 5 H 3 +

m/z 77 m/z 91 (ione tropilio)

trasposizione

C H 2 C H 2

C H 3 91

- C 2 H 2

- C H 2 +

Frammentazioni Semplici

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