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Spettroscopia Spettroscopia di assorbimento nel di assorbimento nel
visibile e visibile e nell’ultraviolettonell’ultravioletto
Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici uso laboratorio ver. 00
I metodi spettroscopici di analisi si basano sulla I metodi spettroscopici di analisi si basano sulla
misura della radiazione elettromagnetica prodotta misura della radiazione elettromagnetica prodotta
o assorbita dagli analiti.o assorbita dagli analiti.
Si possono classificare in funzione della regione Si possono classificare in funzione della regione
dello spettro elettromagnetico (raggi X, dello spettro elettromagnetico (raggi X,
ultravioletto, visibile, infrarosso ecc.) e ultravioletto, visibile, infrarosso ecc.) e
storicamente i primi metodi spettroscopici erano storicamente i primi metodi spettroscopici erano
ristretti all’uso della radiazione visibile.ristretti all’uso della radiazione visibile.
La spettroscopia costituisce un potente La spettroscopia costituisce un potente
strumento di analisi chimica poiché ogni strumento di analisi chimica poiché ogni
elemento chimico, ed in generale ogni sostanza, elemento chimico, ed in generale ogni sostanza,
presenta uno presenta uno spettrospettro caratteristico che fornisce caratteristico che fornisce
informazioni dettagliate e precise sulla sua informazioni dettagliate e precise sulla sua
struttura o sulla sua composizione.struttura o sulla sua composizione.
La luce viene emessa o assorbita sotto forma di La luce viene emessa o assorbita sotto forma di
quanti o fotoni. quanti o fotoni.
L'energia L'energia EE di un singolo fotone è direttamente di un singolo fotone è direttamente
proporzionale alla frequenza di radiazione proporzionale alla frequenza di radiazione e quindi e quindi
inversamente proporzionale alla lunghezza d'onda inversamente proporzionale alla lunghezza d'onda
, secondo la formula:, secondo la formula:
E = hE = h = hc/ = hc/
hh costante di Planckcostante di Planck cc velocità della lucevelocità della luce
Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06
Si definisce Si definisce lunghezza d’ondalunghezza d’onda ( (λλ) la distanza minima ) la distanza minima
tra due punti in fase e viene espressa in: tra due punti in fase e viene espressa in:
Å = 10Å = 10-8-8 cm (raggi X) cm (raggi X)
μμm = 10m = 10-4-4 cm (IR) cm (IR)
nm = 10nm = 10-7-7 cm (UV-Visibile) cm (UV-Visibile)
La La frequenzafrequenza rappresenta il numero di oscillazioni al rappresenta il numero di oscillazioni al
secondo, ossia è il numero di cicli che passa per un secondo, ossia è il numero di cicli che passa per un
punto nell’unità di tempo e viene espressa in secpunto nell’unità di tempo e viene espressa in sec-1-1..
Il colore o la lunghezza d’onda dei quanti di luce Il colore o la lunghezza d’onda dei quanti di luce
emessi o assorbiti da un nucleo, da un atomo o da emessi o assorbiti da un nucleo, da un atomo o da
una molecola, dipende dalla loro struttura interna. una molecola, dipende dalla loro struttura interna.
In un atomo, l’assorbimento o l’emissione di luce di In un atomo, l’assorbimento o l’emissione di luce di
una determinata lunghezza d’onda corrisponde alla una determinata lunghezza d’onda corrisponde alla
transizione di un elettrone da un’orbita ad un’altra. transizione di un elettrone da un’orbita ad un’altra.
Lo spettro di un atomo è sempre a righe e cade Lo spettro di un atomo è sempre a righe e cade
nell’intervallo di frequenze dall’infrarosso al visibile.nell’intervallo di frequenze dall’infrarosso al visibile.
Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06
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TECNICHE SPETTROSCOPICHETECNICHE SPETTROSCOPICHE
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≈ ≈ 10-380 nm (UV) 10-380 nm (UV) ≈ ≈ 380-780 nm (Vis)380-780 nm (Vis)
≈ ≈ 1-1000 1-1000 m (IR) m (IR)
espresso anche come espresso anche come numero d’onda 1/numero d’onda 1/
≈ ≈ 10.000-10 cm10.000-10 cmDott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06
Quando una radiazione d’onda compresa tra Quando una radiazione d’onda compresa tra
190nm e 750nm attraversa una soluzione, gli 190nm e 750nm attraversa una soluzione, gli
elettroni dei legami dei composti presenti in elettroni dei legami dei composti presenti in
soluzione passano allo stato eccitato. Meno soluzione passano allo stato eccitato. Meno
fortemente sono legati gli elettroni dei lagami fortemente sono legati gli elettroni dei lagami
entro la molecola, più elevata sarà la lunghezza entro la molecola, più elevata sarà la lunghezza
d’onda della radiazione assorbita e quindi più d’onda della radiazione assorbita e quindi più
bassa l’energia.bassa l’energia.
SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTOSPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO
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ECCITAZIONE DELL’ETILENEECCITAZIONE DELL’ETILENE
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PP00 = intensità radiazione incidente= intensità radiazione incidente
P P == intensità radiazione emessaintensità radiazione emessab = b = spessore dello strato di soluzionespessore dello strato di soluzione
Quando un fascio di radiazione monocromatica Quando un fascio di radiazione monocromatica
attraversa una soluzione contenente un analita, attraversa una soluzione contenente un analita,
parte della radiazione viene assorbita:parte della radiazione viene assorbita:
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Transmittanza Transmittanza T = P / PT = P / P00
Assorbanza Assorbanza A = log 1 / TA = log 1 / T A = logA = log PP00 / P/ P
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A= A= b cb cA= A= b cb c
LEGGE DI LAMBERT-BEERLEGGE DI LAMBERT-BEER
A = assorbanza
= assorbività molare (l mol-1 cm-1)
b = cammino ottico (spessore cuvetta espresso in cm)
c = concentrazione, espressa in mol l-1
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Se si riporta il segnale (Se si riporta il segnale (TT o o AA) in funzione della ) in funzione della
lunghezza del cammino ottico:lunghezza del cammino ottico:
La risposta dell’assorbanza in funzione della La risposta dell’assorbanza in funzione della
concentrazione è lineare fino ad un certo punto:concentrazione è lineare fino ad un certo punto:
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I cromoforiI cromofori
Sono gruppi presenti in molecole organiche che Sono gruppi presenti in molecole organiche che
hanno la capacità di assorbire la radiazione hanno la capacità di assorbire la radiazione
elettromagnetica nella regione del visibile e in elettromagnetica nella regione del visibile e in
quella dell’ultravioletto. I cromofori più comuni quella dell’ultravioletto. I cromofori più comuni
sono caratterizzati da gruppi insaturi in grado di sono caratterizzati da gruppi insaturi in grado di
delocalizzare le cariche (etileni, acetileni, dieni, delocalizzare le cariche (etileni, acetileni, dieni,
carbonili, azoico, benzeni…). Gruppi in grado di carbonili, azoico, benzeni…). Gruppi in grado di
esaltare l’attività del cromoforo vengono denominati esaltare l’attività del cromoforo vengono denominati
auxocromi.auxocromi.
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Caratteristiche di alcuni cromofori benzeniciCaratteristiche di alcuni cromofori benzenici
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Le variazioni dello spettroLe variazioni dello spettro
SPOSTAMENTOSPOSTAMENTO DENOMINAZIONEDENOMINAZIONE
Lunghezze d’onda Lunghezze d’onda maggioremaggiore batocromicobatocromico
Lunghezze d’onda minoreLunghezze d’onda minore ipsocromicoipsocromico
Assorbanza maggioreAssorbanza maggiore ipercromicoipercromico
Assorbanza minoreAssorbanza minore ipocromicoipocromicoDott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06
200200 nmnm 600600
00A
bs
Ab
s 22 QUERCETINAQUERCETINA
Lo spettro UV-VISLo spettro UV-VIS
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Lo spettro UV-VISLo spettro UV-VIS
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Singolo raggioSingolo raggio
LO SPETTROFOTOMETROLO SPETTROFOTOMETRO
Doppio raggioDoppio raggio
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La La sorgente luminosasorgente luminosa è costituita da lampada a: è costituita da lampada a:
deuterio per la zona dell’UVdeuterio per la zona dell’UV D2 + Ee → D2* → D’ + D’’ + hv (U.V.) spettro della radiazione emessa: ≈ 160-375 nm
tungsteno (W) per la regione visibiletungsteno (W) per la regione visibile temperatura filamento: ≈ 2870 K spettro della radiazione emessa: ≈ 350-2500 nm
xenon (Xe) per coprire entrambe le zonexenon (Xe) per coprire entrambe le zone
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Il Il monocromatoremonocromatore scinde la luce nelle sue lunghezze scinde la luce nelle sue lunghezze
d’onda costituenti, ulteriormente selezionate da una d’onda costituenti, ulteriormente selezionate da una
fenditura successiva. I modelli più utilizzati sono il fenditura successiva. I modelli più utilizzati sono il
prisma e il reticolo di diffrazione:prisma e il reticolo di diffrazione:
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Il Il rivelatorerivelatore permette di trasformare l’intensità permette di trasformare l’intensità
luminosa in un segnale elettrico. Possono essere luminosa in un segnale elettrico. Possono essere
utilizzate fotocellule (a), fotomoltiplicatori (PMT, utilizzate fotocellule (a), fotomoltiplicatori (PMT,
photomultiplier tubesphotomultiplier tubes, b) o fotodiodi., b) o fotodiodi.
b
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Spettrofotometro con rivelatore a serie di diodiSpettrofotometro con rivelatore a serie di diodi
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lati opachilati opachi
LE CUVETTELE CUVETTE
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Lampada: singola sorgente pulsata allo XenonLampada: singola sorgente pulsata allo Xenon
Intervallo: 190-1100nm Intervallo: 190-1100nm
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La taraturaLa taratura
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Differenza spettriDifferenza spettri
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L’influenza del pHL’influenza del pH
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Spettri in derivataSpettri in derivata
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Rilascio di un farmaco da una Rilascio di un farmaco da una formulazioneformulazione
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Grazie allo sviluppo di opportuni Grazie allo sviluppo di opportuni
software, gli attuali spettrofotometri software, gli attuali spettrofotometri
possono essere utilizzati come possono essere utilizzati come
colorimetri, apparecchi che sono in grado colorimetri, apparecchi che sono in grado
di misurare la radiazione luminosa e di misurare la radiazione luminosa e
fornire un dato numerico che corrisponde fornire un dato numerico che corrisponde
alla sensazione visiva percepita alla sensazione visiva percepita
dall’occhio umano. dall’occhio umano.
I COLORIMETRI (O SPETTROCOLORIMETRI)I COLORIMETRI (O SPETTROCOLORIMETRI)
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Lavorando su campioni trasparenti e in Lavorando su campioni trasparenti e in
soluzione è possibile effettuare una soluzione è possibile effettuare una
scansione tra 380 e 780nm, impostare scansione tra 380 e 780nm, impostare
l’osservatore standard e il tipo di sorgente l’osservatore standard e il tipo di sorgente
(in genere 10° e D65, rispettivamente) (in genere 10° e D65, rispettivamente)
ottenendo i valori di coordinate cromatiche ottenendo i valori di coordinate cromatiche
nel sistema CIE del tipo L*a*b*, L*u*v* o nel sistema CIE del tipo L*a*b*, L*u*v* o
L*C*H*. L*C*H*.
In tale modo vengono valutati l’intensità, la In tale modo vengono valutati l’intensità, la
tinta e la saturazione senza bisogno di tinta e la saturazione senza bisogno di
strumenti più costosi muniti della sfera. strumenti più costosi muniti della sfera.
Poiché il colore viene influenzato dalle Poiché il colore viene influenzato dalle
diluizioni, nel caso di campioni molto diluizioni, nel caso di campioni molto
intensi è preferibile ricorrere a celle dal intensi è preferibile ricorrere a celle dal
cammino ottico inferiore ed effettuare le cammino ottico inferiore ed effettuare le
opportune correzioni. opportune correzioni.
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• TintaTinta (Hue, h) = definisce la tonalità (Hue, h) = definisce la tonalità del colore (rosso, giallo, verde, del colore (rosso, giallo, verde, azzurro)azzurro)
• LuminositàLuminosità (L*): indica la diversa (L*): indica la diversa intensità di luce, ossia di quanto la intensità di luce, ossia di quanto la tinta è diluita con il nero. Varia da tinta è diluita con il nero. Varia da zero (nero) a 100 (bianco)zero (nero) a 100 (bianco)
• SaturazioneSaturazione (Chroma, C*): indica di (Chroma, C*): indica di quanto la tinta pura è diluita con il quanto la tinta pura è diluita con il bianco. Varia da zero (bianco) a 100 bianco. Varia da zero (bianco) a 100 (colori spettrali puri, luci (colori spettrali puri, luci monocromatiche) monocromatiche)
I parametri di misura del coloreI parametri di misura del colore
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LA RAPPRESENTAZIONE NELLO SPAZIOLA RAPPRESENTAZIONE NELLO SPAZIO
Spazio CIE L*a*b* (1976)
Spazio CIE xy (1931)
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Lo spazio CIE L*a*b*Lo spazio CIE L*a*b*
luminositàluminositàtinta, tonalitàtinta, tonalità saturazionesaturazione
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LA FUORIMETRIALA FUORIMETRIA
Quando gli elettroni nello stato eccitato di singoletto tornano Quando gli elettroni nello stato eccitato di singoletto tornano allo stato fondamentale di singoletto ed emettono fotoni si allo stato fondamentale di singoletto ed emettono fotoni si parla di fluorescenza, processo che dura tra 10parla di fluorescenza, processo che dura tra 10-10-10 s e 10 s e 10-5-5 s ed s ed è indipendente dalla temperatura. è indipendente dalla temperatura.
Si parla di fluorescenza primaria Si parla di fluorescenza primaria quando la sostanza è fluorescente allo quando la sostanza è fluorescente allo stato naturale, mentre la fluorescenza stato naturale, mentre la fluorescenza secondaria deriva dalla reazione con secondaria deriva dalla reazione con sostanze fluorescenti (derivatizzazione). sostanze fluorescenti (derivatizzazione). Le molecole naturalmente fluorescenti Le molecole naturalmente fluorescenti sono quelle con sistemi fortemente sono quelle con sistemi fortemente coniugati o aromatici e struttura rigida. coniugati o aromatici e struttura rigida. Il picco di emissione si trova sempre a Il picco di emissione si trova sempre a lunghezza d’onda maggiori lunghezza d’onda maggiori (spostamento di Stokes), e pertanto, a (spostamento di Stokes), e pertanto, a energia più bassa. energia più bassa.
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FUORIMETRIFUORIMETRI
Gli strumenti per la spettrofotometria di fluorescenza Gli strumenti per la spettrofotometria di fluorescenza molecolare (spettrofluorimetri) sono simili allo molecolare (spettrofluorimetri) sono simili allo spettrofotometro UV-VIS: è presente una sorgente luminosa spettrofotometro UV-VIS: è presente una sorgente luminosa (allo xeno o alogena al quarzo), un reticolo monocromatore, (allo xeno o alogena al quarzo), un reticolo monocromatore, un alloggiamento per il campione, un secondo reticolo un alloggiamento per il campione, un secondo reticolo monocromatore e il rivelatore. Cambia la geometria perché monocromatore e il rivelatore. Cambia la geometria perché in questo caso il raggio che viene emesso è letto a 90° rispetto in questo caso il raggio che viene emesso è letto a 90° rispetto alla luce incidente. alla luce incidente.
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Esistono alcune peculiarità che richiedono opportuni Esistono alcune peculiarità che richiedono opportuni
accorgimenti tecnici, ad es. l’assenza di fluorescenza provoca accorgimenti tecnici, ad es. l’assenza di fluorescenza provoca
il buio totale, causando quindi problemi di azzeramento della il buio totale, causando quindi problemi di azzeramento della
linea di base. Inoltre la fluorescenza è molto sensibile alla linea di base. Inoltre la fluorescenza è molto sensibile alla
diffusione provocata dal solvente (effetto Rayleigh) o da diffusione provocata dal solvente (effetto Rayleigh) o da
sostanze colloidali (effetto Tyndall), alle variazioni di pH, sostanze colloidali (effetto Tyndall), alle variazioni di pH,
temperatura e viscosità o alla presenza di sostanze temperatura e viscosità o alla presenza di sostanze
sequestranti. Le soluzioni non possono essere troppo sequestranti. Le soluzioni non possono essere troppo
concentrate in quanto una parte della luce emessa può essere concentrate in quanto una parte della luce emessa può essere
riassorbita da altre molecole non eccitate. Normalmente si riassorbita da altre molecole non eccitate. Normalmente si
eseguono diluizioni pari a 10-100 volte rispetto a quelle eseguono diluizioni pari a 10-100 volte rispetto a quelle
utilizzate in spettrofotometria UV-VIS. utilizzate in spettrofotometria UV-VIS.
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SPETTROSCOPIA NELL’INFRAROSSOSPETTROSCOPIA NELL’INFRAROSSO
processo che dura processo che dura tra 10tra 10-10-10 s e 10 s e 10-5-5 s s ed è indipendente ed è indipendente dalla temperatura. dalla temperatura.
È una tecnica molto utilizzata per identificare composti È una tecnica molto utilizzata per identificare composti organici ed inorganici poiché la stragrande maggioranza organici ed inorganici poiché la stragrande maggioranza delle molecole presenta spettri di assorbimento delle molecole presenta spettri di assorbimento caratteristici. Normalmente non viene impiegata per le caratteristici. Normalmente non viene impiegata per le analisi quantitative a causa della bassa sensibilità e analisi quantitative a causa della bassa sensibilità e precisione e delle frequenti deviazioni dalla legge di Beer.precisione e delle frequenti deviazioni dalla legge di Beer.
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Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06
Il gran numero di legami presenti nelle molecole Il gran numero di legami presenti nelle molecole poliatomiche comporta che i dati ottenuti dall’analisi IR poliatomiche comporta che i dati ottenuti dall’analisi IR siano molto complessi e forniscano un’siano molto complessi e forniscano un’improntaimpronta digitaledigitale di di identificazione caratteristica ed unica per ogni particolare identificazione caratteristica ed unica per ogni particolare molecola.molecola.
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GRUPPO LEGAME ENERGIA (approx, cm-1)
hydroxyl O-H 3610-3640
amines N-H 3300-3500
aromatic rings C-H 3000-3100
alkenes C-H 3020-3080
alkanes C-H 2850-2960
nitriles C ΞN 2210-2260
carbonyl C=O 1650-1750
amines C-N 1180-1360
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STRUMENTI PER LA SPETTROSCOPIA IRSTRUMENTI PER LA SPETTROSCOPIA IRsistemi a dispersionesistemi a dispersione
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GlobarGlobar
Lampada di NernstLampada di Nernst
Filo Ni-CrFilo Ni-Cr
GlobarGlobar
Lampada di NernstLampada di Nernst
Filo Ni-CrFilo Ni-Cr
STRUMENTI PER LA SPETTROSCOPIA IRSTRUMENTI PER LA SPETTROSCOPIA IRsistemi a trasformata di Fouriersistemi a trasformata di Fourier
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GLI SPETTRI IRGLI SPETTRI IR
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GLI SPETTRI IRGLI SPETTRI IR
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