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Spettroscopia NMR
(Risonanza Magnetica Nucleare)
•studia l’assorbimento della radiazione a radiofrequenze da parte di
molecole quando i loro atomi sono orientati da un campo magnetico
applicato.
•rispetto alle altre tecniche (es. IR, UV), fornisce un maggior numero
di informazioni di tipo strutturale utili all’identificazione di un composto
organico.
•Dallo spettro NMR di un composto si possono ottenere informazioni
qualitative e quantitative.
•inoltre, conducendo esperimenti sofisticati, è possibile risalire alla
conformazione di molecole molto complesse.
Rabi Fisica 1944
Ernst Chimica 1991
Lauterbur Medicina 2003
Mansfield Medicina 2003
Wutrich Chimica 2002
Bloch Fisica 1952
Purcell Fisica 1952
Spettroscopia NMR
(Risonanza Magnetica Nucleare)
Le particelle elementari che compongono gli atomi, come
elettroni, protoni e neutroni, hanno alcune proprietà di
base:
•Massa
•Carica elettrica (protoni ed elettroni)
•Momento angolare di spin
Momento angolare di spin
Il momento angolare di spin può essere
rappresentato intuitivamente come
un movimento di rotazione intorno al
proprio asse della massa
Il numero quantico principale n definisce il livello di energia dell'elettrone e la
dimensione degli orbitali. Può assumere valori interi positivi: n = 1, 2, 3, 4, 5, 6 ……
Il numero quantico secondario l stablisce il numero dei sottolivelli in cui si differenzia
ciascun livello. Ogni sottolivello raggruppa orbitali della stessa forma definita dal valore di
l compreso tra 0 e (n – 1). Ogni sottolivello corrispondente a ciascun valore di l viene
indicato con una lettera minuscola secondo il seguente schema: valore di l=0 1 2 3 4
simbolo s p d f g Si parla quindi di orbitali di tipo s, orbitali di tipo p, orbitali di tipo d
ecc.
Il numero quantico magnetico m. Determina il numero di orbitali appartenenti a ciascun
sottolivello e il loro orientamento nello spazio. Gli orbitali di uno stesso sottolivello sono
isoenergetici (degeneri); m può assumere tutti i valori interi da -l a +l, compreso lo zero.
Per esempio, per l = 1, m = -1, 0, +1, ossia al sottolivello p appartengono tre orbitali
degeneri orientati secondo gli assi cartesiani: px, py, pz.
Il numero quantico di spin, ms è legato al senso della rotazione, orario o antiorario,
dell'elettrone attorno al proprio asse. Esso può assumere valore +1/2 e -1/2. Ogni orbitale
può contenere al massimo due elettroni (doppietto elettronico) con spin opposto.
?????????
UN PO’ DI RIPASSO:
I nuclei che posseggono una massa dispari o una carica dispari o
entrambe si comportano come se fossero in rotazione (spin)
attorno all’asse nucleare.
Essi posseggono un momento angolare di spin quantizzato P
ed un momento magnetico μ
.
Proprietà magnetiche dei nuclei
Il momento magnetico m è proporzionale al momento di spin
La costante di proporzionalità tra il momento magnetico m ed il
momento angolare nucleare P è detta rapporto giromagnetico (g)
m = g P
Momento magnetico
Il momento magnetico (chiamato anche momento di
dipolo magnetico e indicato dalla lettera greca μ) è un
vettore che caratterizza le proprietà magnetiche di un
corpo: in una barra magnetica, per esempio, il verso
del momento magnetico è diretto dal polo sud al polo
nord della barra.
Un magnete produce un campo
magnetico ed è a sua volta
influenzato dai campi magnetici.
L'intensità del campo magnetico
prodotto è proporzionale al
momento magnetico.
m
http://vam.anest.ufl.edu/forensic/nmr.html
Campo magnetico spento
Campo magnetico acceso
Momento magnetico
Il modulo del momento magnetico è fisso per ogni nucleo, e non può
cambiare in nessun modo.
Può cambiare l’orientazione che il vettore momento magnetico può assumere
nei confronti di una direzione esterna z.
Il modulo del momento magnetico è fisso per ogni nucleo, e non può
cambiare in nessun modo.
Può cambiare l’orientazione che il vettore momento magnetico può assumere
nei confronti di una direzione esterna z.
Momento magnetico
Questa orientazione è quantizzata, ed il vettore momento magnetico può
assumere solo
2I+1 orientazioni
dove il numero quantico di spin I è una costante fisica per ogni nucleo
Numero quantico di spin
Elemento 1H 2H 12C 13C 14N 16O 17O
N° massa 1 2 12 13 14 16 17
N°carica 1 1 6 6 7 8 8
Numero
quantico
di spin ( I ) 1/2 1 0 1/2 1 0 5/2
A ogni numero quantico di spin sono associati degli
stati di spin -I<m<+I (Δm=±1)
A ogni numero quantico di spin sono associati degli
stati di spin -I<m<+I (Δm=±1)
2
1
2
1
I = 1/2 I = 1
+
_
0
z
h_
h_
m=1 m=0
m=-1
m=1
m=-1
m=0
La Spettroscopia NMR si basa sul fatto che i nuclei atomici possono
essere orientati in un campo magnetico* (B0) e assorbire una
radiazione a radiofrequenze ad una determinata frequenza.
Fenomeno di
Risonanza Magnetica
Radiazione spenta Processi di
Rilassamento
Magnetico
hn=DE DE
B0
La transizione avverra’ quando
hn= DE, e comportera’ un
assorbimento di energia
* Lo spazio entro il quale un magnete esercita la sua azione prende il nome di Campo magnetico
I=1/2
In assenza di campo magnetico
In presenza di campo magnetico
2I+1=2*1/2+1=2
Precessione del Momento
Magnetico Nucleare
I=1/2 B0
La frequenza di precessione è
chiamata frequenza di Larmor
n=(g/2p)B0
In presenza di campo magnetico
B0
a
b
DE1 DE2
B0
a
b
DE1 DE2
Nell’NMR la differenza di energia tra gli stati nucleari è indotta dal campo
magnetico esterno, e può quindi essere variata.
0BE gD
Poiché i due stati di spin hanno energia diversa, è quindi possibile indurre il
passaggio da uno stato all’altro mediante un quanto di radiazione elettromagnetica
di frequenza
p
ggn
2
00 B
h
B
h
E
D
Principale problema della spettroscopia NMR
kT
Ee
N
NkT
ED
D
1a
b
kT
B
N
N01
g
a
b
LA SENSIBILITA’
Distribuzione di Boltzmann
a
a
aa
a
a
a
aa
aa a
ab
b
bb
b
b
b
b
b b
b
b
a
hn
hn
hn
hn
hn
hn
hn
hn
b
hn
Principale problema della spettroscopia NMR
kT
Ee
N
NkT
ED
D
1a
b
kT
B
N
N01
g
a
b
LA SENSIBILITA’
Distribuzione di Boltzmann
a
a
aa
a
a
a
aa
aa a
ab
b
bb
b
b
b
b
b b
b
b
a
hn
hn
hn
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hn
hn
b
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Principale problema della spettroscopia NMR
kT
Ee
N
NkT
ED
D
1a
b
kT
B
N
N01
g
a
b
LA SENSIBILITA’
Distribuzione di Boltzmann
La sensibilità di un esperimento NMR aumenta:
• all’aumentare del campo applicato;
•all’aumentare del rapporto giromagnetico
0BE gD
Come si induce una transizione tra differenti livelli energetici?
•Nell’NMR cio’ viene realizzato attraverso l’irradiazione del nucleo con una
radiazione a radiofrequenze (r.f) la cui componente magnetica possa interagire
con i dipoli nucleari.
•La transizione avrà luogo quando hn= DE; ciò comporterà un assorbimento di
energia. In pratica la frequenza n della radiazione a r.f. dovra’ essere uguale alla
frequenza di Larmor (ogni transizione comporta un cambiamento di spin)
•Secondo le regole di selezione, saranno permesse solo le transizioni in cui il numero
quantico m vari di 1: Dm = 1
PRINCIPI BASILARI DI UN ESPERIMENTO NMR
Spettrometro NMR
900 MHz (21.2 T)
Il campione viene eccitato mediante pulsi di RF
di durata molto breve (ms).
Il segnale rivelato dallo spettrometro è quello rilasciato dai nuclei
durante la fase di rilassamento
(ritorno all’equilibrio).
dttitfF )2exp()()( pnn
FID
Freq. Larmor
Spettroscopia NMR in trasformata di Fourier (FT)
Spettroscopia NMR in trasformata di Fourier (FT)
Vi sono persone in grado di riconoscere le singole note nel caso di piu' note suonate
contemporaneamente, anche se questo processo diventa piu' difficile all'aumentare delle
note
Provate a suonare più note simultaneamente. Riuscireste a dire quali frequenze
sono state suonate? La trasformata di Fourier puo' farlo!
Cambiate ora le ampiezze relative delle note. Riuscireste a determinare le
intensita' relative delle note con il vostro orecchio? La trasformata di Fourier puo'
farlo!
L'operazione effettuata dalla trasformata di
Fourier puo' essere assimilata ad un musicista che
ascolta un insieme di toni (segnale nel dominio del
tempo) e ne determina le note (contenuto in
frequenza).
La trasformata inversa di Fourier puo' essere
assimilata ad un musicista che vede le note
(frequenze) sullo spartito musicale e le converte in
toni (segnali nel domino del tempo).
Spettroscopia NMR in trasformata di Fourier (FT)
Vi sono persone in grado di riconoscere le singole note nel caso di piu' note suonate
contemporaneamente, anche se questo processo diventa piu' difficile all'aumentare delle
note
Provate a suonare più note simultaneamente. Riuscireste a dire quali frequenze
sono state suonate? La trasformata di Fourier puo' farlo!
Cambiate ora le ampiezze relative delle note. Riuscireste a determinare le
intensita' relative delle note con il vostro orecchio? La trasformata di Fourier puo'
farlo!
L'operazione effettuata dalla trasformata di
Fourier puo' essere assimilata ad un musicista che
ascolta un insieme di toni (segnale nel dominio del
tempo) e ne determina le note (contenuto in
frequenza).
La trasformata inversa di Fourier puo' essere
assimilata ad un musicista che vede le note
(frequenze) sullo spartito musicale e le converte in
toni (segnali nel domino del tempo).
Spettroscopia NMR in trasformata di Fourier (FT)
Spettroscopia NMR in trasformata di Fourier (FT)
Se tutti i nuclei dello stesso tipo di una molecola precedono alla stessa
frequenza di risonanza
quanti segnali ci aspettiamo di trovare nel corrispondente
spettro NMR?
Es. Quanti segnali ci aspettiamo
dallo spettro 1H-NMR dell’ etanolo
(CH3-CH2-OH)?
Sotto l’influenza del campo magnetico
esterno gli elettroni tendono ad
assumere un movimento rotatorio, e
ruotando generano essi stessi un campo
magnetico.
Il campo magnetico generato si oppone al campo magnetico esterno
Pertanto, il nucleo sarà sottoposto ad un campo magnetico effettivo
minore di quello applicato, è cioè schermato dagli elettroni.
LO SPOSTAMENTO CHIMICO (CHEMICAL SHIFT)
Nonostante tutti i nuclei di una certo tipo
(per esempio 1H) siano esattamente identici,
essi risuonano a frequenze leggermente
diverse purché si trovino in intorni chimici
differenti.
http://faculty.ccc.edu/cabrams/projects/nmrtutor/INTRO.dcr
Beff=B0(1-s) s= costante di schermo
che dipende dalla
struttura elettronica in prossimità del nucleo in esame
neff=n0(1-s) FREQUENZA DI LARMOR
EFFETTIVA
CAMPO MAGNETICO
EFFETTIVO
SCHERMAGGIO
LO SPOSTAMENTO CHIMICO
La posizione del centro del segnale NMR è chiamata
spostamento chimico (chemical shift, d) e viene espressa in
ppm:
610*)(
rospettromet
oriferimentcampione
n
nnd
riferimento=tetrametilsilano (TMS) Si(CH3)4
LO SPOSTAMENTO CHIMICO
n=g/2pB0
Il principale fattore che determina il
chemical shift di un protone è la densità
elettronica del relativo idrogeno.
d- d
C H Cl Elemento
elettronegativo
d- d
Composto CH3X
Elemento X
Elettronegatività of X
Chemical shift d
CH3F CH3OH CH3Cl CH3Br CH3I CH4 (CH3)4Si
F O Cl Br I H Si
4.0 3.5 3.1 2.8 2.5 2.1 1.8
4.26 3.40 3.05 2.68 2.16 0.23 0
TMS Più
deschermati
CHEMICAL SHIFT PROTONICO
CHEMICAL SHIFT PROTONICO
idrogeni alifatici primari, secondari e terziari
risuonano a valori di ppp via via più alti.
L’elettronegatività del carbonio è bassa per cui
tutti e tre i tipi d idrogeno si trovano al di sotto dei
2 ppm
CHEMICAL SHIFT PROTONICO
Come nel caso delle spettroscopie di assorbimento anche per l’NMR è possibile formulare
alcune regole di additività che permettono di prevedere, con ragionevole approssimazione , il
chemical shift dei vari nuclei.
Per quanto riguarda la spettroscopia protonica il calcolo è ristretto a 1) derivati metilenici
derivati metilenici 2) derivati etilenici.
REGOLE DI SHOOLERY PER I DERIVATI METILENICI
Serve per calcolare il chemical shift di derivati del tipo X-CH2-Y. Si parte dal c.s. del metano (
0.233 ppm) e si addizionano i contributi tabulati per i vari sostituenti:
d=0.233+Somma(contributi)
-C 0.248
-C-C 0.244
-C 0.147
-C 0.006
c
c c
c c
C=C H H
H H BO
I protoni sono deschermati
Linee di forza del campo magnetico
indotto
ANISOTROPIA DI CHEMICAL SHIFT
I protoni olefinici (legati a carboni sp2) hanno chemical shifts molto più
alti dei protoni legati a carboni sp3, con valori tipici di d 5-6 ppm. Ciò è
dovuto alla nuvola elettronica p che può generare campi magnetici
relativamente intensi.
elettroni p
DeschermatI
H H
Linee di forza del campo magnetico indotto dagli
elettroni p
CORRENTE DI ANELLO NEL BENZENE
B0
http://faculty.ccc.edu/cabrams/projects/nmrtutor/BENZENE.dcr
aumenta lo schermaggio
aumenta d
NON DOBBIAMO RICORDARE TUTTI I VALORI DI CHEMICAL SHIFT A MEMORIA !!!!
alifatico
C-H
CH vicino a un legame
p
C-H dove C è legato ad un
atomo elettronegativ
o
alcheni
=C-H benzene
CH aldeidi
CHO acidi
COOH
2 3 4 6 7 9 10 0
X-C-H X=C-C-H
(ppm)
L’intensità di un segnale nello spettro NMR protonico è
proporzionale al numero di protoni che lo genera.
INTEGRAZIONE
CH3OH metanolo
3
1
CH3CH2OH etanolo
1H-NMR
Es. HO-CH2-
Es HO-CH3
CH3CH2OH
CH3
Tripletto 1:2:1 per accoppiamento con il CH2
CH2
I protoni del metilene sono meno schermati di quelli del metile (d più grande). Quartetto 1:3:3:1 per accoppiamento con il CH3
OH
il protone dell’OH è ancora meno schermato. Qui scambia “rapidamente” con le altre molecole ed è quindi disaccoppiato dagli altri nuclei
Integrali dei multipletti. Sono proporzionali al numero di nuclei che contribuiscono al
multipletto.
CH3CH2OH
STRUTTURA FINE & ACCOPPIAMENTO SCALARE (SPIN-SPIN)
deriva dall’interazione magnetica tra i nuclei presenti nella molecola
e viene trasmesso attraverso la polarizzazione degli elettroni di legame
un gruppo di N nuclei magneticamente equivalenti scompone il segnale NMR di un nucleo o un gruppo di nuclei non
magneticamente ai primi in 2NI+1 componenti.
nuclei magneticamente equivalenti
stesso chemical shift e stesso accoppiamento con altri gruppi di nuclei
nella stessa molecola.
3 nuclei A equivalenti
2 nuclei B equivalenti
BA nn ,
frequenze di risonanza
Ma se c’è accoppiamento, i nuclei A risentono della situazione dei nuclei
B, e viceversa. In tal caso ogni riga dovuta ad un gruppo di nuclei
equivalenti si separa (splitting) in un numero di righe corrispondente ai
diversi stati di spin del gruppo vicino.
Se tra i due gruppi di nuclei non ci
fosse accoppiamento...
nA nB
NMR
nA nB
Gli integrali dei
due multipletti
stanno nello
stesso rapporto
del numero di
protoni
equivalenti
corrispondenti
1 2 1
Tripletto di righe 1 3 3 1
Quartetto di righe
3 : 2
J J J J J
J = 0
J 0
3 nuclei A equivalenti
2 nuclei B equivalenti
Accoppiamenti uguali con nuclei vicini
Poiché l’ accoppiamento spin-spin è
dovuto alle interazioni tra i momenti
magnetici nucleari, che sono
indipendenti dal campo magnetico
applicato B0, le costanti di
accoppiamento J sono indipendenti dal
campo magnetico applicato e risultano
uguali in qualunque spettrometro.
Il valore di J decresce con l’aumentare
del numero di legami tra i nuclei
accoppiati
J(Hz)
costante di accoppiamento scalare
Functional Group JHH (Hz)
6 – 8
11 – 18
6 – 15
4 – 10
6 – 10
8 – 11
a,a: 8 - 14 a,e: 0 - 7 e,e: 0 – 5
cis: 6 - 12 trans: 4 - 8
Le intensità relative dei segnali di un multipletto generato
dalla vicinanza di N nuclei a spin ½ possono essere previste
sulla base dei valori numerici del TRIANGOLO DI PASCAL
Numero e intensità delle righe numero di H
0
1
2
3
4
5
1
1 1
1 1 2
1 1 3 3
1 1 5 5 10 10
1 1 4 4 6
ecc.
TRIANGOLO DI PASCAL
I=1/2
Triangolo di Pascal
Se due nuclei (o gruppi di nuclei) non chimicamente equivalenti accoppiano con il medesimo nucleo (o gruppo di nuclei), l’effetto dei nuclei va considerato separatamente.
CH3CH2CH2CH2…….
esempio
Accoppiamenti diversi con nuclei vicini
le differenze in chemical shift sono maggiori della costante di
accoppiamento (d»J), e l’identificazione dei nuclei magneticamente
equivalenti e´ di facile risoluzione.
•Molteplicità 2nI+1
•Triangolo di Pascal se I=1/2
•Segnali equidistanti
spettro del primo ordine
le differenze in chemical shift sono comparabili con le costanti di
accoppiamento (d≤J) e l’attribuzione dei segnali risulta più
complicata. In tal caso bisogna ricorrere all'analisi quanto
meccanica dello spettro.
spettro di ordine superiore
CH3
2,2-DIMETILBUTANO
13C-NMR
STRUTTURA FINE DEGLI SPETTRI 13C-NMR
Accoppiamento 1JCH
Dominante negli spettri NMR del 13C
Spettro 13C
Accoppiato
Spettro 13C
Accoppiato
Spettro 13C
Disaccoppiato
I TEMPI DI RILASSAMENTO T1 E T2
L’energia assorbita dai nuclei sottoposti alla risonanza magnetica viene
dissipata mediante processi di rilassamento magnetico nucleare, che
regolano il ritorno all’equilibrio della magnetizzazione. Questi processi
sono chiamati
•Rilassamento spin-reticolo (che comporta uno scambio di energia tra il
nucleo e l’ambiente circostante)
•Rilassamento spin-spin (che comporta uno scambio diretto di energia
elettromagnetica tra gli spin nucleari)
I due processi sono rispettivamente regolati da due constanti di tempo T1
e T2 il cui valori dipendono dalla struttura molecolare del campione e dal
suo stato di aggregazione (solido, liquido)
NMR in biologia
La risonanza magnetica nucleare viene utilizzata per
determinare la struttura di macromolecole
Attraverso l’identificazione di biomarcatori in patologie oncologiche è possibile
diagnosticare alcune forme di cancro.
Nei campioni biologici ha permesso l’identificazione di composti di rilevanza
farmacologica-tossicologica (es. ricerca di un farmaco, pesticidi, droghe d’abuso,
veleni).
Informazioni sulla possibilità di molecole di piccole dimensioni di legarsi
ad un recettore proteico alterandone la funzionalità.
NMR di biomolecole
Problema: Come si fa ad assegnare tutti i segnali di
uno spettro NMR di una proteina?
Etanolo
SPETTROSCOPIA NMR BI-DIMENSIONALE
2D-NMR
6 4
2 5
3
Etil crotonato
glicina
isoleucina
valina
glicina
isoleucina
valina val
leu
Spettro NMR di una Miscela di aminoacidi??? Esempio: Estratto acquoso di Bottarga (amino acidi, nucleotidi, ac.organici,…)
HETCOR non è altro che la versione eteronucleare dell’esperimento di
correlazione COSY.
La tecnica Hetcor correla gli shifts del 13C con quelli dell’1H attraverso
l’accoppiamento tramite un legame. Gli shifts dei carboni e degli idrogeni che
sono legati l’uno all’altro sono letti come segnali fuori diagonale.
Tale tecnica permette di misurare gli shifts dei due nuclei in un solo
esperimento, e allo stesso tempo permette di stabilirne la connettivita’.
HETeronuclear CORrelation(COSY 1H-13C)
HETCOR
HETeronuclear CORrelation(COSY 1H-13C)
J-resolved Spectra