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Determinazione simultanea di FANS in Determinazione simultanea di FANS in matrici complesse mediante HPLC-DAD.matrici complesse mediante HPLC-DAD.Confronto tra materiali a base di silice e Confronto tra materiali a base di silice e polimerici nell’estrazione liquido-solido polimerici nell’estrazione liquido-solido (SPE) impiegati per la preparazione del (SPE) impiegati per la preparazione del campione.campione.
Università degli studi “G. D’Annunzio” Chieti-Pescara Facoltà di farmacia
Corso di Laurea in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche
Farmaci antinfiammatori non steroideiFANS
Attività farmacologica
Anti-infiammatoria Antipiretica Analgesica
Usi
Terapia del dolore Artrite reumatoide Cefalea Patologie cardiovascolari
Meccanismo d’azione
Inibizione ciclossigenasi (COX1 e COX2)
Farmacocinetica
Ben assorbiti oralmente Metabolismo epatico Escrezione renale
FANS oggetto di studio
FANS
O
COOH
O
N
O COOH
O
COOH
O
COOH
F
COOH
O
N
COOH
O
Cl
COOH
Indometacina
Furprofene
Ketoprofene
Fenbufene
Ibuprofene
FlurbiprofeneIndoprofene
Caratteristiche dei FANS impiegati
Strutture PM (Da)
LogP pKa Siti accettori dilegame
idrogeno
Siti donatori di legame idrogeno
357 3.40 3.75 5 1
273 3.80 3.19 4 1
281 2.44 3.74 4 1
O
N
COOH
O
Cl
O
COOH
O
N
O COOH
Caratteristiche dei FANS impiegati
Strutture PM (Da)
LogP pKa Siti accettori dilegame
idrogeno
Siti donatori di legame idrogeno
254 3.20 3.88 3 1
206 3.60 4.85 2 1
244 3.57 4.40 2 1
254 3.20 4.22 3 1
O
COOH
COOH
F
COOH
O
COOH
Scelta della cartuccia SPE
Chimica
Massa adsorbente
Grandezza cartuccia
Materiali silicei
Cromatografia diretta Interazioni polari
Cromatografia inversa Interazioni idrofobiche
OSi
OH
C N
HO
OH
H2N
SO3
Materiali polimerici
Idrofobici PS-DVB
Misti PVP-DVB
N
N
O
O
Confronto tra materiali
Silicei
Poco costosi Facile introduzione di
gruppi polari o scambiatori ionici
Stabili 2<pH<8
Polimerici
Elevata area superficiale specifica (m2/g)
Moltepicità di interazioni (Van der Waals, legame idrogeno, π-π)
Facilmente modificabili
Stabili 2<pH<14
Massa adsorbente
Silicei capacità ≈5% massa di adsorbentePolimerici ≈10% massa di adsorbente
Es. 60 mg 6 mg (inclusa la matrice)
Il processo SPE
1. Condizionamento - Equilibrazione
3. Lavaggio
2. Caricamento
4. Eluizione
Condizionamento-Equilibrazione
Condizionamento Equilibrazione
Solventi organici come metanolo o acetonitrile servono per tenere “bagnata” la fase stazionaria.
Con acqua o con una soluzione tampone la fase stazionaria viene solvatata e resa disponibile per l’interazione con gli analiti.
Il processo SPE
= Matrice= Interferenza= Analita= Acqua/soluzione tampone= Solvente di lavaggio= Solvente d’eluizione
LavaggioCaricamento Eluizione
Polarità degli analiti+
Composizione della matrice+
Requisiti del solvente
= Meccanismo SPE
Scelta del metodo
Analita Matrice Meccanismo
Non-polare Acquosa Non polare
Polare Organica non-polare Polare
Ionico Acquosa/Organica Scambio ionico
Parte sperimentale
Pre-trattamento del campione
Estrazione liquido-solido SPE
Analisi HPLC
Preparazione e pre-trattamento
Ogni campione da 1 mL di plasma contiene:
5 µg di ketoprofene; 10 µg di furprofene, fenbufene, flurbiprofene, indoprofene; 20 µg di indometacina ed ibuprofene.
Eliminazione delle proteine plasmatiche:
1 mL plasma spiked + 2 mL di acetonitrile 2 gtt di acido ortofosforico
Centrifugazione a 2100 rpm per due volte
Separazione
Metodica SPE
1 mL MeOH 1 mL tampone fosfato
pH 7.4
1 mL di campione
1 mL di MeOH
1 mL di miscela MeOH-tampone fosfato pH 7.4
al 5%
Condizionamento - Equilibrazione
Caricamento
Lavaggio
Eluizione
Analisi HPLC
HPLC Waters ® con iniettore Rheodyne a sei vie
Rivelatore a serie di diodi (DAD)
Colonna cromatografica Hyperclone ® C18 (250 mm x 4.6 mm, 5 µm) Phenomenex®
Precolonna Pelliguard ® C18 (20 mm x 4.60 mm, 40 µm) Supelco®
Fase mobile: miscela binaria CH3CN-Tampone fosfato 20 mM , pH 2.5, 50:50 (v/v)
Velocità di flusso 1 mL/min
Colonna termostatata a 20 °C ± 1 °C
Analisi HPLC
O
N
COOH
O
Cl
O
COOH
O
COOH
COOHF
COOHO
COOH
O
N
O COOH
Linearità
[ ] µg/mL
Furprofene Indoprofene Ketoprofene Fenbufene Flurbiprofene Indometacina Ibuprofene
2.5 1,89·106
±1.76·104*
1.15·106
±5.16·103
1.40·106
±1.55·104
2.13·106
±1.56·104
1.55·106
±7.52·103
3.83·106
±1.01·104
8.39·105
±1.37·104
RSD% 0.9 0.4 1.1 0.7 0.4 0.2 1.6
25 2.24·106
±2.66·104
1.27·106
±3.97·104
1.61·106
±2.47·104
2.52·106
±8.44·104
1.83·106
±1.83·105
5.96·106
±4.13·104
1.16·106
±1.64·105
RSD% 1.2 3.2 1.5 3.3 9.9 0.69 14
50 4.46·106
±7.45·104
2.35·106
±8.28·104
3.22·106
±4.88·104
4.96·106
±4.33·104
3.86·106
±3.93·104
1.13·106
±4.35·104
2.34·106
±1.55·105
RSD% 1.6 3.5 1.5 0.8 1.0 3.8 6.6
75 6.87·106
±1.33·105
3.68·106
±1.01·105
5.03·106
±1.52·105
7.59·106
±1.63·104
5.75·106
±2.50·104
1.83·106
±4.62·104
3.52·106
±4.81·104
RSD% 1.9 2.7 3.0 2.1 0.4 2.5 1.4
100 9.27·106
±6.24·105
4.98·106
±3.87·105
6.63·106
±4.15·104
1.07·107
±7.03·105
8.14·106
±5.37·105
2.42·106
±1.52·105
4.40·106
±2.98·105
RSD% 6.7 7.7 6.2 6.7 6.6 6.3 6.7
* = DS, deviazione standard
Linearità
[ ] µg/mL
Furprofene Indoprofene Ketoprofene Fenbufene Flurbiprofene Indometacina Ibuprofene
125 1.11·107
±6.96·105
5.92·106
±7.38·105
8.05·106
±3.17·105
1.25·107
±1.14·105
9.85·106
±1.36·105
2.93·106
±4.98·105
4.50·106
±2.00·105
RSD% 6.3 12.4 3.9 0.91 13.8 19.9 4.4
150 1.31·107
±6.22·105
6.91·106
±3.32·105
1.03·107
±4.87·105
1.60·107
±8.16·105
1.13·107
±5.71·105
3.75·106
±4.69·105
7.04·106
±3.69·105
RSD% 4.7 0.48 4.7 5.1 5.0 12.5 5.2
175 1.49·107
±7.01·104
7.88·108
±3.92·105
1.16·107
±1.11·106
1.83·107
±6.99·105
1.42·107
±6.02·104
4.27·107
±1.98·105
8.00·106
±3.71·105
RSD% 4.7 4.9 9.61 3.8 4.2 4.6 4.6
200 2.30·106
±2.73·105
9.55·106
±3.99·105
1.39·107
±4.32·105
2.11·107
±1.04·106
1.71·107
±5.40·105
5.04·107
±5.44·104
1.02·106
±6.11·105
RSD% 1.2 4.2 3.1 4.9 3.1 1.1 5.9
250 2.47·107
±1.65·105
1.19·107
±1.47·104
1.60·107
±1.05·105
2.52·107
±1.11·105
1.98·107
±5.42·105
5.82·106
±9.75·104
1.20·107
±9.99·104
RSD% 0.56 0.1 0.65 0.44 2.74 1.6 0.8
* = DS, deviazione standard
Linearità
Rette ottenute per ogni analita
N
O COOH
O
COOH
Indoprofene
Ketoprofene
O
COOH
O
Furprofene
µg/mL
µg/mL
µg/mL
Linearità
O
COOH
F
COOH
Fenbufene
Flurbiprofene
µg/mL
µg/mL
O
N
COOH
O
Cl
COOH
Linearità
Indometacina
Ibuprofene
µg/mL
µg/mL
Risultati e discussione
R% = Recupero percentuale
100AreaArea
R%(standard)
(estratti)
Sep-Pak Vac ®, Waters ®
R%
Sep-Pak Vac ®, Waters ®
SiO
OO
Si
Si O
O
Si OSi
O
O
O
O
O
O
O
O O
O
Area superficiale Granulometria Porosità %C Capacità Impaccamento
325 m2/g 37-55 µm 125 Å 12 1 mL 50 mg
Oasis HLB ®, Waters ®
PVP-DVB
Oasis HLB ®, Waters ®
Area superficiale Granulometria Porosità Capacità Impaccamento
810 m2/g 25-35 µm 80 Å 1 mL 30 mg
O
N
COOH
O
Cl
N
O COOH
O
COOH
O
Oasis HLB Sep-Pak Vac
810 m2/g 325 m2/g
25-30 µm 37-55 µm
Indometacina
Furprofene
Indoprofene
StrataTM-X, Phenomenex ®
PVP-DVB
R%
StrataTM-X, Phenomenex ®
Area superficiale Granulometria Porosità Capacità Impaccamento
800 m2/g 33 µm 85 Å 1 mL 30 mg
O
N
COOH
O
Cl
Indometacina
F
COOH
COOH
Ibuprofene
Flurbiprofene
Bond-Elut TM Plexa TM, Varian ®
PS-DVB
R%
Bond-Elut TM Plexa TM, Varian ®
Area superficiale Granulometria Porosità Capacità Impaccamento
800 m2/g 40-55 µm 90 Å 1 mL 30 mg
O
COOH
Fenbufene
O
COOH
Ketoprofene
Evolute ABN ®, Argonaut®
PS-DVB
R%
Evolute ABN ®, Argonaut®
Area superficiale Granulometria Capacità Impaccamento
506 m2/g 17-50 µm 1 mL 25 mg
Evolute ABN Bond-Elut
506 m2/g 800 m2/g
17-50 µm 40-55 µm
Una visione completa…
CONCLUSIONI
Ottenimento di condizioni sperimentali all’interno delle quali tutti i FANS sono stati recuperati in percentuali ottimali.
In tempi di analisi contenuti è stato possibile separare e analizzare simultaneamente sette analiti.
Inoltre…
Questo metodo sviluppato può essere trasferito in campo clinico per il controllo sulle terapie che prevedono l’uso di FANS.