Post on 30-Sep-2018
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Trattamenti conservativi in oncologia
ginecologica, qualità di vita e desiderio di salute
“Crioconservazione dei gameti e
del tessuto ovarico”
L. Gianaroli, S. Resta, M.C. Magli, A.P. Ferraretti
S.I.S.Me.R. - Unità di Medicina della Riproduzione - Bologna
www.iiarg.com www.sismer.it
Declino della fertilità femminile in relazione all’età
Lobo et al., Potential options for preservation of fertility in women, N Engl J Med 2005, 353: 64-73
La fertilità femminile può essere
compromessa da qualunque trattamento
che:
diminuisca il n° di follicoli primordiali
colpisca l’equilibrio ormonale
interferisca col funzionamento delle
ovaie, delle tube, dell’utero e della
cervice.
Indicazioni femminili e maschili alla preservazione
della fertilita’
Neoplasie
genitali o gonadiche
del sistema ematopoietico (LMC, LMA, LLA, Linfoma Hodgkin e non Hodgkin)
solide giovanili
Malattie
autoimmuni
LES
A. Reumatoide
Gromerulonefrite acuta
Malattia di Bechet
Altro
Anomalie cromosomiche (delezioni, Sindrome di Turner, Klinefelter)
Endometriosi
Cisti ovariche ricorrenti
“Social freezing”
Neoplasie
Le nuove strategie antitumorali
hanno portato negli ultimi anni ad
un aumento della sopravvivenza
media nelle giovani donne affette
da neoplasie ginecologiche e non,
ponendo l’attenzione sugli effetti
a lungo termine delle terapie
onco-soppressive e sulla qualità
di vita delle pazienti dopo il
trattamento.
Preservazione della fertilita’: indicazioni oncologiche
Età
Condizione ovarica
Tipo di patologia oncologica
Tipo di chemioterapia/radioterapia
Dosi e numero di cicli effettuati
Preservazione della fertilita’ femminile:
tossicita’ dei trattamenti oncologici
Early Menopause and Infertility
Ovarian Reserve ⇩⇩⇩
Primordial Follicle Count ⇩⇩⇩
• La probabilità stimata di
menopausa precoce è di circa il
25% a 30 anni.
Letourneau et al., Acute ovarian failure underestimates age-specific
reproductive impairment for young women undergoing chemotherapy
for cancer, Cancer 2012, 118: 1933-9
• Danno diretto alle ovaie
• Danno all’asse ipotalamico-pituitario
• Dose dipendente
• Età dipendente
• Dipendente dalla zona irradiata
• Può anche colpire la funzione uterina
Chemioterapia Radioterapia
Preservazione della fertilita’ femminile:
tossicita’ dei trattamenti oncologici
AGENTI FARMACI MECCANISMI D’AZIONE
Alchilanti
Ciclofosfammide,
Mostarde Azotate,
Chloroethyl nitrosurea,
Melfalan, Tiotepa.
Si intercalano nei filamenti di DNA, interrompono la
sintesi di RNA e proteine.
Cisplatino e
analoghi
Cisplatino,
Carboplatino.
Interferiscono con la sintesi di DNA ma non con
quella di RNA e proteine
Alcaloidi della Vinca
(induttori di
aneuploidie)
Vincristina, Vinblastina. Si legano alla tubulina e causano dissociazione
dell’apparato dei microtubuli
Antimetaboliti
Metotressato,
Aminopiridina,
5-Fluorouracile,
Citarabina.
Agiscono come falsi substrati nelle reazioni di
sintesi del DNA e dell’RNA.
Inibitori delle
Topoisomerasi
(Radiomimetics)
Bleomicina,
Actinomicina,
Doxorubicina,
Daunorubicina
Interagiscono con il complesso DNA-enzima,
impedendo la rottura dei filamenti single strands di
DNA mediati dalla topoisomerasi I.
Nuovi agenti Paclitaxel. Agiscono sui microtubuli
Meccanismi d’azione dei farmaci antitumorali
Jeruss JS, Woodruff TK, Preservation of fertility in patients with cancer, N Engl J Med, 2009; 360: 902-11
Opzioni per la preservazione della fertilita’
Preservazione della fertilità maschile
Preservazione della fertilità maschile
Liquido seminale
Spermatozoi
Prelievo epididimario (MESA)
Prelievo testicolare (TESA)
Biopsia testicolare (TESE)
Prospettive future: liofilizzazione
epididimo
testicolo
Prelievo del fluido seminale dall’epididimo
M.E.S.A/TE.S.A
Microsurgical Epididymal Sperm Aspiration
Testicular Sperm Aspiration
Prelievo di una minima quantità di tessuto
testicolare
TE.S.E.
Testicular Sperm Extraction
Liofilizzazione
Kusakabe et al., Mouse and human spermatozoa can be freeze-dried without damaging their chromosomes, Hum Reprod 2008, 23:233-239
Il cariotipo non
mostrava aberrazioni
numeriche o strutturali.
Il processo di liofilizzazione non causa danno ai cromosomi spermatici.
Spermatozoi reidratati da
2 donatori sono stati
iniettati in ovociti
enucleati di topo.
I cromosomi degli spermatozoi
sono stati analizzati alla prima
divisione dello zigote.
La maggior parte aveva una
costituzione normale.
Liofilizzazione vs congelamento
30 campioni di sperma
Conta
Motilità
Morfologia
Vitalità
Frammentazione DNA
Birifrangenza
Due aliquote per ciascun campione
Criopreservazione in
N2 liquido
Liofilizzazione
Lo scopo dello studio era di confrontare la liofilizzazione con la
tecnica consolidata del congelamento in azoto liquido.
Gianaroli et al., DNA integrity is maintained after freeze-drying of human spermatozoa, Fert Stert 2012, 97: 1067-1073
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Motilità Vitalità
fresco
Reidratato
Scongelato
Gianaroli et al., DNA integrity is maintained after freeze-drying of human spermatozoa, Fert Stert 2012, 97: 1067-1073
%
Conta/ ml
62±44 x 106
48±29 x 106
55±31 x 106
a
a
b
b
Nessuna variazione significativa nella conta
Calo significativo nella motilità e vitalità spermatica dopo lo scongelamento
Nessuna motilità, nè vitalità dopo la reidratazione.
abP<0.001
Liofilizzazione vs congelamento
Liofilizzazione
- Sebbene la vitalità degli spermatozoi e la loro motilità siano totalmente
compromesse dopo la liofilizzazione, la struttura della cromatina
spermatica non è alterata rispetto al campione fresco. A differenza del
congelameto in azoto liquido, la procedura non altera l’integrità del DNA.
-Le caratteristiche di birifrangenza sono per lo più ben conservate negli
spermatozoi reidratati , suggerendo che le strutture protoplasmatiche
delle teste degli spermatozoi non siano alterate. Al contrario, la
proporzione di cellule spermatiche con una birifrangenza anomala della
testa aumenta incredibilmente dopo lo scongelamento.
- La conservazione dell’integrità del DNA, che risulta superiore in
confronto con la crioconservazione in azoto liquido, spinge a considerare
un’applicazione clinica della liofilizzazione.
Gonado-protezione ormonale (e.g. analoghi GnRH)
– L’efficacia della protezione delle gonadi attraverso la manipolazione ormonale è stata valutata solo in studi molto piccoli riguardanti pazienti oncologici maschi.
– L’evidenza suggerisce che la terapia ormonale negli uomini non è efficace nel preservare la fertilità qualora siano stati sottoposti a chemioterapia altamente sterilizzante.
Meistrich ML, Shetty G, Hormonal suppression for fertility preservation in males and females, Reproduction 2008, 136: 691-701
...alternative
Potenziali opzioni future (non ancora testate nell’uomo)
– Crioconservazione del tessuto testicolare e re-impianto
– Innesto di testicolo in topi SCID
Jahnukainen K, Stukenborg JB, Clinical review: Present and future prospects of male fertility preservation for children and adolescents,
J Clin Endocrinol Metab 2012, 97: 4341-51
Jahnukainen et al., Autologous ectopic grafting of cryopreserved testicular tissue preserves the fertility of prepubescent monkeys that
receive sterilizing cytotoxic therapy, Cancer Res 2012, 72: 5174-8
Preservazione della fertilità femminile
Crioconservazione di ovociti
L’azione protettiva del crioprotettore dipende:
dal tempo di esposizione al crioprotettore
(deve essere abbastanza lungo da permettere una sufficiente disidratazione della cellula ma non troppo dal momento che si può alterare il pH intracellulare)
dalla temperatura alla quale avviene l’esposizione
(la cellula è esposta inizialmente a basse concentrazioni di crioprotettore a T ambiente in modo da creare il giusto gradiente di concentrazione che da inizio alla deidratazione e ad un ingresso più lento del crioprotettore stesso)
dallo stadio maturativo dell’ ovocita
Lo scopo dei crioprotettori è ridurre la formazione di cristalli di ghiaccio che
possono danneggiare in maniera irreversibile le strutture citoplasmatiche e
di membrana
Criopreservazione di ovociti – possibili danni
Zona pellucida hardening
Polar body degeneration/fusion
Membrane permeability
Oocyte ageing
Meiotic spindle depolymerization
Cytoplasmic and Cytoskeletron damage
Impact on oocyte physiology
Congelamento lento
Le metodiche utilizzate per crioconservare gli ovociti si dividono in:
Vitrificazione
Utilizzo del crioprotettore PROH
Richiede un congelatore
programmabile
Tempo necessario circa 2 ore
Tecnica ormai consolidata
Utilizzo dei crioprotettori DMSO e Etilen
Glicole ad alta concentrazione
Non richiede uno strumento specifico
Tempo necessario circa 15 minuti a
supporto (in genere 2-3 ovociti)
Metodica relativamente recente
Crioconservazione di ovociti
La prima gravidanza al mondo ottenuta da un ovocita
congelato con protocollo di vitrificazione venne riportata
presso il S.I.S.Me.R. nel 1999 (Kuleshova et al., 1999)
Il tempo ottimale di congelamento è tra 39 e 40 ore dopo
la somministrazione dell’ hCG.
Accanto all’ottimizzazione del
protocollo di congelamento degli
ovociti, è stato dimostrato che il
tempo che intercorre tra la
somministrazione dell’ hCG e il
congelamento degli ovociti gioca
un ruolo fondamentale nello
sviluppo embrionale e nel
successo della gravidanza
(S.I.S.Me.R.)
Fattori importanti per la crioconservazione di ovociti
Ferraretti et al., Factors affecting thawed oocyte viability suggest a customized policy of embryo transfer, Fert Steril 2010, 94: 1308-1313
Ovociti scongelati hanno comunque minor probabilità di essere fertilizzati e
svilupparsi in zigoti di buona qualità e, conseguentemente, in embrioni
rispetto ad ovociti freschi, indipendentemente dall’età della paziente.
I ridotti tassi di fertilizzazione e di
cleavage che si osservano negli
ovociti congelati rispetto ai freschi
suggeriscono che, sebbene gli ovociti
sopravvivano allo scongelamento, il
processo di congelamento lento ha un
impatto negativo sul potenziale di
sviluppo dell’ovocita stesso.
Ovociti congelati PROH vs freschi
Magli et al., Impact of oocyte cryopreservation on embryo development, Fert Steril 2010, 93: 510-516
Ovociti vitrificati vs freschi
Cobo et al., Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method, Fert Steril 2008, 89: 1657-1664
Slow-freezing Vitrification
No. cycles 852 140
Age 35,3 ± 3,2 36,7 ± 4,1
Survival Rate (%) 2855/4148 (68,8) 593/844 (70,3)
Fertilization Rate (%) 1688/2252 (74,9) 378/506 (74,7)
Cleavage rate (%) 1465/1688 (86,8) 332/378 (87,8)
4CGr1 (+2) (%) 352/1465 (24)a 131/332 (39,5)a
6-8CGr1 (+3) (%) 192/842 (22,8)b 113/234 (48,3)b
No. Transferred cycles (%) 705 (82,7) 104 (74,3)
OOCYTE CRYOPRESERVATION SISMER experience 2004-2012
a,b P<0.001
Clinical pregnancy rate
Implantation rate (FHB)
Spontaneous abortion rate
%
Slow-freezing Vitrification
0
10
20
30
40
14,9%a
23,1%a
a) P<0.05
OOCYTE CRYOPRESERVATION SISMER experience 2004-2012
105/705 25/104 125/1380 25/202 27/105 9/25
9,1% 12,4%
25,7% 36%
Crioconservazione del tessuto ovarico
Consente di crioconservare frammenti ovarici in pazienti
oncologiche (anche pediatriche) indipendentemente dallo stadio
del ciclo mestruale.
Consente di ottenere centinaia di follicoli primordiali contenenti
ovociti immaturi, che risultano molto resistenti ai processi di
congelamento e scongelamento.
Non presuppone alcuna stimolazione ormonale dell’ovaio
Rappresenta una possibile alternativa nei casi di tumori estrogeno-
dipendenti.
A fronte di tali indubbi vantaggi, lo svantaggio principale
nell’utilizzo di tessuto ovarico congelato riguarda la bassa qualità
ovocitaria, nonchè il rischio di trasferire cellule residue
cancerogene.
Crioconservazione del tessuto ovarico
La corticale ovarica è una struttura estremamente complessa che
comprende diversi istotipi cellulari e follicoli in vari stadi di sviluppo con
cellule di diverse dimensioni (cellule tecali, cellule della granulosa, ovociti),
strutture extracellulari compatte (cellule dello stroma) e formazioni cavitate
(antro-follicolari, vasi sanguigni).
Campione
fresco
Campione
congelato/scongelato
Tecnica di prelievo di tessuto corticale ovarico
- Congelamento
lento
- Vitrificazione
S.J. Silber, Ovary cryopreservation and transplantation for fertility Preservation, Molecular Human Reproduction 2012, 18: 59–67
Vitrificazione del tessuto ovarico
Frammenti per
analisi
Biopsia del tessuto
corticale ovarico
Tessuto tagliato in
piccoli frammenti
I frammenti attraversano
differenti concentrazioni di
soluzione di vitrificazione
I frammenti vengono posti in
un cryotube vuoto
Il cryotube chiuso è immerso
in azoto liquido
Due sono gli approcci per quanto riguarda l’autotrapianto di tessuto ovarico:
Sonmezer et al., Orthotopic and heterotopic ovarian tissue transplantation, Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 2010, 24: 113-26
- TRAPIANTO ORTOTOPICO, in cui i frammenti di corticale sono trapiantati nella
loro localizzazione originaria (fossetta ovarica).
S.J. Silber, Ovary cryopreservation and transplantation for fertility Preservation, Mol Hum Reprod 2012, 18: 59–67
Donnez et al., Live birth after allografting of ovarian cortex between genetically non-identical sisters, Hum Rep 2012, 26:1384-8
Crioconservazione del tessuto ovarico
-TRAPIANTO ETEROTOPICO, dove i frammenti possono essere trapiantati
sottocute in vari siti (braccio, avambraccio, zona sovra-pubica).
Crioconservazione del tessuto ovarico
- Minore invasività intervento
- Facile accesso
- Ripresa della funzionalità endocrina
MA
- Implicazioni psicologiche
- Risultati dubbi sulla possibilità di gravidanza
Oktay et al., Four spontaneous pregnancies and three live births following subcutaneous transplantation of frozen banked ovarian tissue: what is the
explanation?, Fertil Steril 2011,95: 804.e7-10
Kim SS, Assessment of long term endocrine function after transplantation of frozen-thawed human ovarian tissue to the heterotopic site: 10 year longitudinal
follow-up study, J Assisted Reprod Genet 2012, 29: 489-93
Crioconservazione del tessuto ovarico: studi funzionali
S.J. Silber, Ovary cryopreservation and transplantation for fertility Preservation”, Molecular Human Reproduction 2012, 18: 59–67
Dopo il trapianto di tessuto
ovarico crioconservato i
livelli di FSH sierico si
abbassano fino a livelli
normali, simili a quelli
ottenuti con il trapianto di
tessuto ovarico fresco.
Crioconservazione del tessuto ovarico in SISMeR
Anno Pazienti
1997 1
1998 1
1999 1
2000 1
2001 3
2002 2
2003 -
2004 1
2005 1
2006 -
2007 -
2008 -
2009 1
2010 -
2011 1
2012 1
TOT=14 PZ
Ad oggi in tutto il mondo
sono nati più di 20 bambini
da trapianto di tessuto
ovarico, fresco o congelato. S.J. Silber, Ovary cryopreservation and transplantation for fertility
Preservation, Mol Hum Reprod 2012, 18: 59–67
In alcuni casi il tessuto
ovarico trapiantato ha
permesso una ripresa della
funzionalità ovarica per più
di 7 anni. Andersen et al., Long-term duration of function of ovarian tissue
transplants: case reports, Reprod Biomed Online 2012 25: 128-32
Crioconservazione del tessuto ovarico: risultati clinici
S.J. Silber, Ovary cryopreservation and transplantation for fertility Preservation, Mol
Hum Reprod 2012, 18: 59–67
REDUCED OVARIAN RESERVE
Wallace Kelsey Model
Wallace and Kelsey. Human Ovarian Reserve from Conception to the Menopause
PLoS One. 2010; 5(1): e8772.
Xenotrapianto: tessuto ovarico umano in topi SCID.
Kim et al., Assessment of the integrity of human oocytes retrieved from cryopreserved ovarian tissue after xenotransplantation”, Hum Reprod 2005, 20:
2502-8
Nottola et al., Cryopreservation and xenotransplantation of human ovarian tissue: an ultrastructural study, Fertil Steril 2008, 90: 23-32
..alternative
Coltura e IVM di follicoli primordiali: “2 step culture system”:
coltura di tessuto seguita da isolamento di follicoli e coltura
degli stessi. In alternativa, utilizzo di una matrice di supporto
3D. Abir et al., In vitro maturation of human primordial ovarian follicles: clinical significance, progress in mammals, and methods for growth evaluation,
Histol. Histopatho 2006, 21: 887-98
Picton et al., The in vitro growth and maturation of follicles, Reproduction 2008, 136: 703-15
Telfer et al., A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin, Hum Rep
2008, 23: 1151-8
Woodruff TK, Preserving fertility during cancer treatment, Nat Med 2009, 15: 1124-5
Conclusioni
Il futuro riproduttivo dei pazienti oncologici può essere tutelato grazie alle
tecniche di preservazione della fertilità esistenti, tenendo in conto il tipo di
patologia, il tipo di trattamento, il tempo a disposizione, l’età del paziente e le
prospettive future.
Sicuramente la maggior esperienza per quanto riguarda la preservazione
della fertilità femminile si ha nel campo della crioconservazione degli ovociti,
ma per i casi in cui ciò non sia possibile, la crioconservazione del tessuto
ovarico offre una speranza di un futuro riproduttivo, anche se i dati sono
limitati ed è ancora considerata una tecnica sperimentale.
Conclusioni
Risulta fondamentale stabilire una stretta
collaborazione tra gli oncologi, gli specialisti di
medicina della riproduzione e il team biologico,
nell’ottica di offrire al paziente la migliore
opzione possibile.