FISH, CGH, ARRAYFISH, CGH, ARRAY--CGH:CGH:tecniche di biologia molecolare duttili tecniche di biologia molecolare duttili

e con ampio spettro di utilizzoe con ampio spettro di utilizzo

Dott.ssaDott.ssa Ludovica Verdun di Ludovica Verdun di CantognoCantognoAnatomia Patologica III Anatomia Patologica III MolinetteMolinette TorinoTorino

Cariotipo a 550 bande G: risoluzione 3/5Mb

FISH: risoluzione 100Kb

SONDA PER LA S. DI DiGEORGE

ideogrammi

Analisi convenzionale (microscopio ottico)

1956: i cromosomi umani sono 46

1960: prima definizione di cariotipo

1966: nomenclatura dettagliata cromosomi

Bandeggio G

bande CHIARE:

- ricche in GC- molti geni

Bande SCURE:

- ricche in AT- pochi geni

centromero

Telomero p

Telomero q

risoluzione cariotipo: 400 550 850

Cromosoma 7

Diverse risoluzioni di bandeggio G

(numero bande totali per corredo aploide)

p = braccio cortoq = braccio lungo

numerazione delle bande dalcentromero al telomero

CASI RISOLVIBILI CASI RISOLVIBILI TRAMITE IL SOLO TRAMITE IL SOLO

CARIOTIPOCARIOTIPO

LA: W+ per trisomia 18

Cariotipo: 47,XY, +13

Cariotipo: 45,XY,der(14;21)(q10;q10)

SP

Cariotipo: 46,XY,der(9;13)

SP: infertilità di coppia

Cariotipo: 46,XY,inv(6)(p25q23)

SP: infertilità di coppia

Individuazione punti di rottura inv(6)

Cariotipo: 46,XY,inv(17)(p11.2q21)

SP:in padre LA con stessa aberrazione

Individuazione punti di rottura inv(17)

CASI CHE RICHIEDONO CASI CHE RICHIEDONO APPROFONDIMENTO APPROFONDIMENTO TRAMITE FISHTRAMITE FISH

SP: lieve ritardo psicomotorio

Cariotipo 46,XY,dup10q o ins..?

Pz. con ritardo psicomotorio:traslocazione Y/autosoma(?)

LIQUIDO AMNIOTICO

CROMOSOMA MARCATORE SOVRANNUMERARIO

•DA-DAPI NEGATIVO

•ACROCENTRICO

•NON SATELLITATOè un iso(18p)?

PAZIENTE WILLIAMS POSITIVO?

? ?

FISH: Fluorescence In SituHybridization

Dal 1980

MATERIALE ADATTO ALLA FISH

•La FISH può essere effettuata su DNA fissato su vetrino proveniente da qualsiasi tipo di tessuto: • liquido amniotico (LA)• sangue periferico (SP)• aspirato midollare (AM)• sezioni di tessuto (in paraffina o congelate)

•Possono essere ibridate sia metafasi che nuclei in interfase. La lettura ed interpretazione dei risultati sarà ovviamente differente nei due casi.

LAVAGGI DI STRINGENZA

La rinaturazione del DNA è indipendente dal pH che può variare da 5 a 9 senza influire sulla reazione

pH: generalmente si lavora a pH neutro

Alte temperature denaturano la doppia elica di DNA (99°-100°C)

Temperatura: > è la teperatura > è la stringenza(a parità di concentrazione di formamide)

Solvente organico in grado di ridurre la stabilità termica del DNA: permette la sua denaturazione a temperature più basse

Formamide: > è la concentrazione > è la stringenza (a parità di temperatura)

Interagiscono con i gruppi fosfato del DNA: diminuiscono la repulsione elettrostatica tra le due eliche facilitandone il riavvicinamento

Cationi monovalenti (SSC):> è la concentrazione < è la stringenza

SONDE PAINTINGSONDE PAINTING

Colorano per intero un singolo cromosoma o parti di esso (arm

painting)

LA

SONDA PAINTING CROMOSOMA 7

LA 701/06

Cariotipo: 46,XY,inv(7)(q22q31.3)?

LA 701/06

SONDA PAINTING CROMOSOMA 7

Non ci sono ulteriori riarrangiamentia carico di questo cromosoma

Conferma ipotesi formulata in bande G:è una inversione paracentrica

SP: ritardo spicomotorio lieve

Cariotipo 46,XY,dup10q o ins..?

SP SONDA PAINTING CROMOSOMA 10

dup(10)

Conferma cariotipo:46,XY,dup(10)(q21.1)

LIQUIDO AMNIOTICO

CROMOSOMA MARCATORE SOVRANNUMERARIO

•DA-DAPI NEGATIVO

•ACROCENTRICO•NON SATELLITATOè un iso(18p)?

LA

confermato: si tratta di un i(18)(p10)

SONDA PAINTING CROMOSOMA 18

SONDE ALFOIDISONDE ALFOIDI

Evidenziano le regioni centromeriche dei singoli cromosomi

(con queste sonde non è possibile discriminare tra i cromosomi (1)/5/19,

13/21, 14/22)

CARIOTIPO: 47,XX,+mar

Caso SP163/04

SP163/04

COLORAZIONE DA-DAPI: POSITIVO

IPOTESI:

•Crom. 15•Crom. 9•Crom. 16•Crom. 1

Sonda PRADER-WILLI/ANGELMAN

SP163/04

MARCATORE NEGATIVO

SP163/04

SONDA CENTROMERO CROMOSOMA 9

MARCATORE NEGATIVO

SP163/04

SONDA CENTROMERO CROMOSOMA 16

MARCATORE NEGATIVO

SP163/04

SONDA CENTROMERO CROMOSOMA 1

MARCATORE POSITIVO

Si tratta di un der(1)

Cromosoma riarrangiato der(?)

Centromero attivo

Il centromero attivo di questo cromosoma provienedal cromosoma 17 per cui, indipendentemente dalla provenienza dell’altro materiale che lo compone, si tratta di un der(17)

Sonde:-centrom. crom. 17-Her-2

Linea cellulare SKBR3:da carcinoma mammarioHER2 amplificato

DIAGNOSI DI ANEUPLOIDIE SU NUCLEI DI LIQUIDO

AMNIOTICO

X

X

21

2121

MD 40/06 Sonda alfoide XSonda alfoide Y

MDS (Sindrome Mielodisplastica):valutazione allotrapianto: trapianto di midollo maschio (donatore) su femmina (paziente)

crom X

crom Y

MD 40/06

Sonda alfoide XSonda alfoide Y

Letti 800 nuclei e 20 metafasi :

Tutte “maschio” (donatore)

3 NUCLEIXY

LEUCEMIA LINFATICA CRONICA A CELLULE B (B-LLC): SONDA CENTROMERO CROMOSOMA 12

Nucleo con tris. 12

Nucleo normale

la trisomiadel cromosoma 12è un marker di questa patologia che spesso sfugge al cariotipo in bande G per selezione sfavorevole delle metafasi con trisomia in coltura

Nonostante il cariotipo negativo, la FISH sui nuclei in interfase rivela una popolazione pari al 40% positiva per trisomia del cromosoma 12

SONDE PER REGIONI A SINGOLA SONDE PER REGIONI A SINGOLA COPIACOPIA

Evidenziano:•regioni correlate a sindromi da geni contigui

•regioni la cui duplicazione, delezione o traslocazione è correlata a neoplasie

PRINCIPALI SINDROMI DA PRINCIPALI SINDROMI DA MICRODELEZIONEMICRODELEZIONE

SINDROME LOCALIZZAZIONE CROMOSOMICA

REGIONE SONDA

% EVIDENZIATA CON FISH

DiGeorge/ (DGS) 22q11.2 D22S75 (N25) 85%

Velocardiofacciale

(VCFS) 22q11.2 D22S75 (N25) 53%

Prader Willi (PWS) 15q11-q13 SNRPN 70%

Angelman (AS) 15q11-q13 D15S12 70%

Williams (WS) 7q11.23 Gene Elastina 97%

Miller-Dieker 17p13.3 LIS-1 90%

Smith-Magenis 17p11.2 D17S258 95%

Ittiosi X-linked (STS) Xp22.3 Gene Steroido

Solfatasi 85%

NEGATIVA

SINDROME DI WILLIAMS

crom. 7

crom. 7

Williams:7q11.23 locusGene Elastina (ELN)

Controllo: 7q31

Sonde:

crom. 7POSITIVA

del(7)

SINDROME DI WILLIAMS

Sonda Williams:7q11.23 locusGene Elastina (ELN)

Sonda di Controllo: 7q31

PZ. WILLIAMS POSITIVO

NEGATIVA

Sindrome di DiGeorge •Sonda DiGeorge22q11.2 (locusTuple1)

•Sonda Controllo22q13.3 (locusARSA)

POSITIVA Sindrome di DiGeorge

•Sonda DiGeorge22q11.2 (locusTuple1)

•Sonda Controllo22q13.3 (locusARSA)

PZ. DiGEORGE POSITIVO

SINDROME PRADER-WILLI/ANGELMAN

Controllo:locus D15Z1 (centr.) e PML (15q22)

PWS/AS:15q11-13 Locus SNRPN

Sonde:

NEGATIVA

SINDROME PRADER-WILLI/ANGELMAN

crom. 15del(15)

POSITIVA

CROMOSOMA MARCATORE •SOVRANNUMERARIO

•DICENTRICO

•DA-DAPI POSITIVO

CASO 1

SONDA PRADER-WILLI/ANGELMAN 15q11-q13: negativoSONDA CENTROMERO CROMOSOMA 15: due segnali

Il Crom. Marcatore è un derivativoisodicentrico 15p

mar

CASO 1