Le tecniche molecolari nella Le tecniche molecolari nella diagnosi delle epatitidiagnosi delle epatiti
dott. Danila BassettiMicrobiologia e VirologiaStruttura Semplice Sierologia AutoimmunitàOspedale S.Chiara di Trento
Biologia Molecolare ed EpatitiBiologia Molecolare ed Epatiti
Integrazione nella loro gestione clinica con finalità di:
� Diagnosi delle forme acute e croniche� Prognosi e predittività dell’efficacia
terapeutica� Monitoraggio clinico e terapeutico
AA““FecFec--oraleorale””
““ParenteraliParenterali””
Epatiti viraliEpatiti virali
Trasmissione Trasmissione
entericaenterica
TrasmissioneTrasmissione
parenteraleparenterale
F, ? altreF, ? altre
EE
NANBNANB
BB
DD
CC
Epatiti virali Epatiti virali -- Vie di trasmissioneVie di trasmissione
FF
Clinica epatiti Clinica epatiti BB e e CC: : variabili influentivariabili influenti
Virus:Virus:• Attività replicativa
• “Viral load”• Genotipo• Mutazioni da ceppo
“wild type”• Resistenza a farmaci
anti-virali
Paziente:Paziente:• Età (sesso)• Immunodepressione• Gravidanza
• Trasmissione verticale
• Comorbidità• Genetica (IL28R, IFN λ)
• Insulinoresistenza
Biologia Molecolare ed epatiti B / CBiologia Molecolare ed epatiti B / C
QUANDO
?
PERCHE’
?
COME
?
Forme CRONICHE
Forme ACUTE
HBV e Biologia MolecolareHBV e Biologia Molecolare
� (HBV-DNA qualitativo)� HBV-DNA quantitativo (“viral load”)� Ricerca mutanti o varianti “escape”� Genotipizzazione� Ricerca resistenze ad antivirali
4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 52
Epatite acuta B: marcatori sierologici
ItteroItteroSintomiSintomi
⇑⇑⇑⇑⇑⇑⇑⇑ ALTALTHBeAgHBeAg AntiAnti --HBeHBe
AntiAnti --HBcHBc
AntiAnti --HBsHBs
IgM antiIgM anti --HBcHBc
HBsAgHBsAg
Settimane dopo lSettimane dopo l ’’esposizioneesposizione
Tito
loT
itolo
HBVHBV--DNADNA
Biologia Molecolare Biologia Molecolare ed Epatite B acutaed Epatite B acuta
� Generalmente non necessaria� Utile nella identificazione di:
� varianti HBV “escape”� forme c.d. Occulte
Settimane dopo l’esposizioneSettimane dopo l’esposizione
Tito
loT
itolo
IgM antiIgM anti --HBcHBc
Total antiTotal anti --HBcHBc
HBsAgHBsAg
AcutaAcuta(6 mesi)(6 mesi)
HBeAg
CronicaCronica(anni)(anni)
anti-HBe
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 52 annianni
Cronicizzazione: decorso sierologico tipicoHBV DNAHBV DNA
HBVHBV--DNA: indicatore prognosticoDNA: indicatore prognostico
Incidenza Cumulativa di HCC(%) (n=3653)
Chen CJ et al. JAMA. 2006;295:65-73.Iloeje UH et al. Gastroenterology. 2006;130:678-686.
<300 (Undetectable) 300-9999 10,000-99,999 100,000-999,999 ≥1 million
REVEAL Studio: Livelli HBV DNA ed evoluzione
1.37%
3.57%
14.89%
1.30%
12.17%
0
5
10
15
20
3.6
9.7
2.0
1.0
10.6
0
2
4
6
8
10
12
Multivariata-rischio relativo di cirrosi (n=3482)
Viral Load at Baseline
Distribuzione genotipi HBVDistribuzione genotipi HBV
F
CD
E
A
DD
D
C
Ba
F
A,B,C,D
BjA,B,C,D
F
AD
H
H
G
Cronicizza A>D Rischio fibrosi C>BPre core mutazione B,C,D>A Rischio mortalità F>A o DHBeAg sieroconv B versus C Risposta a IFN A>D, B>C
Genotipizzazione HBVGenotipizzazione HBV�Genotipo C
� Più spesso associato con malattia epatica severa e HCC rispetto al genotipo B
�Genotipo B� Associato con sieroconversione da HBeAg
ad anti-HBe in età più giovane rispetto al genotipo C
�Genotipi A e B� Più alto tasso di risposta antivirale e
perdita HBeAg in seguito a terapia con pegIFN alfa rispetto al genotipo D e C
Keeffe EB, et al. Clin Gastroenterol Hepatol. 2006;4:936-962.
HBV Genotyping Line Probe Assay
Marker line Conj. control Amp. control
Genotype A
Genotype B
Genotype C
Genotype D
Genotype E
Genotype F
Genotype G
123456789
10111213141516
Infezione cronica da HBV: evoluzione
Infezione cronica
7-10%
Epatitecronica
Portatoreasintomatico
60-65%
35-40%
CirrosiOLT/decesso
HCC
25-30%
5%
Nucleoside/Nucleoside/nucleotidenucleotideanaloghianaloghi
InterferoneInterferoneαα
Terapie per Epatite B Cronica
Azione Antivirale
Azione Antivirale
Immunomodulazione
T helper cell
Natural killer cell
Cytotoxic T cell
Antigen Presenting Cell
B cell
Terapia epatite B: Terapia epatite B: due approcci diversidue approcci diversi
Interferone (PEG-IFN)� Meccanismo immunostimolante-antivirale� Terapia “finita” (48 settimane)
Analoghi nucleosid(t)ici (NUCs)� Meccanismo antivirale puro� Terapia “long term”
Scopo monitoraggio terapia Scopo monitoraggio terapia Epatiti B e CEpatiti B e C
� Misura efficacia antivirale:HBV,HCV
� Predizione dell’outcome: HBV,HCV
� Modifica precoce della terapia• sospensione per inefficacia: HCV
• adattamento: HBV
� Diagnosi di resistenza: HBV
Risposta virologica HBVRisposta virologica HBV
Risposta ad IFN
Risposta a NUCs
HBV-DNA <2000 UI/mL alla 24 sett. terapia
HBV-DNA <15 UI/mL entro 48 sett. terapia
Terapia Epatite B cronicaTerapia Epatite B cronica
LAM FTCADV
LdTETV TDF
Barriera genetica
Pot
enza
Nucleotidi analoghiNucleosidi analoghi
IFN
Farmaci antiFarmaci anti --HBVHBV
ATTIVITA’ ANTIVIRALE : potenza e barriera genetica
Resistenza ad analoghi nucleos(t)idici
0
10
20
30
40
50
60
70
80
LAM
ADV
ETV
ETV in LAM-RLDT
LDT in EUTDF
Year 1
Year 3
Year 5
Year 1Year 2Year 3Year 4Year 5
Lai et al. Clin Infect Dis. 2003;36:687-96; Lok et al Gastroenterology 2003; 125 : 1714-1722; Zoulim et al J Viral Hepatitis 2006;13:278-288; Hadzyiannis et al NEJM 2005; 352 : 2673-2681; Chang et al. NEJM 2006; 351: 1001-1010; Lai et al NEJM 2006; 354: 1011-1020; Lai et al Abstract # 91, AASLD 2006. Colonno R et al. Abstract #110, AASLD 2006. Globe study. Data on file. Keefee et al. Clin Gastroenterol Hepatol 2008; 6:268-274.
Terminal protein Spacer Reverse transcriptase RNase H
F G A C D EB
1 344YMDD
M204V or I
M204I
A181V or T N236T K241E
K318Q
V173L
L180M
M250
S202T184
I169Lamivudine-resistant mutationsAdefovir-resistant mutations
Entecavir-resistant mutations (requires pre-existing M204I/V mutation)
Telbivudine-resistant mutations
Mutazioni nel genoma HBV causa di Mutazioni nel genoma HBV causa di resistenza ad antiviraliresistenza ad antivirali
K. Kowdley.
Resistenza HBV ad antivirali: Resistenza HBV ad antivirali: ibridazione inversa
Profili di Resistenza indotti da mutazioni viraliProfili di Resistenza indotti da mutazioni virali
HBV e gravidanzaHBV e gravidanza
Kits HBVKits HBV--DNADNA
Kits HBVKits HBV --DNA: DNA: sensibilitsensibilit àà e ranges dinamicie ranges dinamici
Virus Epatite C
Prevalenza HCV nel mondo
1, 2, 31, 2, 3 1, 2, 31, 2, 31, 31, 3
1,31,3
11
33
44
4444
4,54,5
Asia: 6Asia: 633
Europe8.9 million(1.03%)
The Americas13.1 million(1.7%)
Africa31.9 million(5.3%)
Southeast Asia32.3 million(2.15%)
Western Pacific62.2 million(3.9%)
Eastern Mediterranean21.3 million(4.6%)
World Health Organization. Hepatitis C: global prevalence: update. 2003. Farci P, et al. Semin Liver Dis. 2000;20:103-126. Wasley A, et al. Semin Liver Dis. 2000;20:1-16.
Stimati 170-180 milioni di portatori (3,1%) globale
HCV e Biologia MolecolareHCV e Biologia Molecolare
� (HCV-RNA qualitativo)� HCV-RNA quantitativo (“viral load”)� Genotipizzazione
Marcatori di Infezione da HCVMarcatori di Infezione da HCV
Epatite acuta che guarisce
Sintomi +/-
Tempo dopo esposizione
Titolo
anti-HCV
ALT
Normale
0 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4annimesi
HCV RNA
Ag
Epatite acuta che cronicizza
SintomiSintomiSintomiSintomi+/+/+/+/----
Tempo dopo esposizione
Titolo
Anti-HCV
ALT
Normale
0 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4annimesi
HCV RNA
Ag
Kit HCVKit HCV--RNA: RNA: sensibilitsensibilitàà e ranges dinamicie ranges dinamici
Biologia Molecolare ed Epatite C acutaBiologia Molecolare ed Epatite C acuta
� Generalmente non necessaria� Utile nella identificazione di:
� fasi pre-sierologiche
� trasmissione verticale (monitoraggio neonato 0,3,12 mesi)
HCV genotipiHCV genotipi
Prevalenza genotipi HCV nel mondo
Genotipo e risposta alla terapiaGenotipo e risposta alla terapia
� I genotipi 1 (a,b) e 4 presentano una minore risposta alla terapia
� “Viral load baseline” e genotipo sono i due principali predittori indipendenti di risposta sostenuta alla terapia (SVR)
� Sono previsti schemi posologici differenziati tra genotipi (dose e durata terapia)
� Tuttavia pazienti con lo stesso genotipo e con gli stessi livelli di viremia basale hanno differenti risposte alla terapia → anche altri fattori condizionano la risposta alla terapia (insulinoresistenza, mutazione IL28R per IFN λ)
Timing del monitoraggio virologicoTiming del monitoraggio virologico
Risposta virologica alla terapia: Risposta virologica alla terapia: HCVHCV--RNARNA
� RVR: negativo a 4 settimane di terapia
� EVR: completa negativo a 12 sett.
parziale calo > 2 log10 a 12 sett.
� NR: < 2 log10 da valori base a 12 sett.
� non-vRVR : calo <0.8 log10 a 48 ore predittività negativa per SVR
�SVR: negatività a 6 mesi da fine terapia
DeDefinizione della risposta virologica finizione della risposta virologica alla 4 e 12 settimana di terapiaalla 4 e 12 settimana di terapia
Monitoraggio terapia epatite C genotipo 1
Monitoraggio terapia epatite C genotipo 2/3
HBV DNA HBV DNA –– HCV RNA HCV RNA
Il rilevamentodel genoma virale è il parametro
più attendibileper la diagnosi e per il
monitoraggio dell’infezione
Sonde specifiche per il target
Tecniche di biologia molecolare
Take-home MessagesNella gestione delle epatiti B e C la Nella gestione delle epatiti B e C la Biologia Molecolare Biologia Molecolare èè in grado di:in grado di:
�� Confermare la diagnosi Confermare la diagnosi (f. acute e croniche)(f. acute e croniche)
�� Definire indici prognosticiDefinire indici prognostici�� Orientare la scelta di opzioni terapeutiche Orientare la scelta di opzioni terapeutiche
(farmaco, posologia, durata, sospensione)(farmaco, posologia, durata, sospensione)
�� Monitorare outcome clinico e terapeuticoMonitorare outcome clinico e terapeutico�� Confermare trasmissione maternoConfermare trasmissione materno --fetalefetale
GRAZIE dellGRAZIE dell’’Attenzione!Attenzione!
ERROR: undefined
OFFENDING COMMAND: BASSETTI_Le
STACK:
(11)
/Title
()
/Subject
(D:20110131084841+01’00’)
/ModDate
()
/Keywords
(PDFCreator Version 0.9.5)
/Creator
(D:20110131084841+01’00’)
/CreationDate
(5317841)
/Author
-mark-