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Negli ultimi anni si è osservata una maggior sensibilità da parte dei medici verso lo studio della trombofilia, che è sfociata in un numero sempre maggiore di richieste di
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numero sempre maggiore di richieste di esami di Laboratorio
Il Laboratorio ha un ruolo chiave nella
stratificazione iniziale della diagnosi di Trombofilia purché dia i corretti
suggerimenti nell’esecuzione dello
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suggerimenti nell’esecuzione dello screening e l’interpretazione giusta nella
caratterizzazione del difetto
1500
2000
2500
TEST SPECIALISTICI anno 2012
esami per DH
9
0
500
1000
1500
savona pietra
Presidio
esami per DH
esami per esterni
esami per interni
�Quali soggetti esaminare
�Quali alterazioni trombofiliche ricercare
�Quali test eseguire
�Quando eseguire i test
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�Quando eseguire i test
SINTOMATICI
� Uno o più precedenti episodi di TEV� idiopatica�dopo stimoli di modesta entità� con storia familiare positiva per TEV
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� con storia familiare positiva per TEV
• Trombosi venose superficiali recidivanti su vena sana• Trombosi venose in sede non usuali (escluse le
occlusioni venose retiniche)• Necrosi cutanea indotta da anticoagulanti orali• Porpora fulminante neonatale
SINTOMATICISINTOMATICI
� Patologia arteriosa in età giovanile (< 55 anni)limitatamente a:� LAC� Anticorpi anticardiolipina ed anti β2 Glicoproteina I (IgG
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� Anticorpi anticardiolipina ed anti β2 Glicoproteina I (IgG ed IgM)
� Omocisteina
Le alterazioni trombofiliche eredofamiliari possono essere ricercate solo in casi selezionati (es. pazienti con pregresso ictus o TIA secondario a FOP)
SINTOMATICI
� Pregressa patologia della gravidanza
� aborti ricorrenti (>= 3 o 2 con almeno un cariotipo fetale normale)� morte endouterina fetale� pre-eclampsia� HELP syndrome
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� HELP syndrome� ritardo di accrescimento intrauterino
Linee guida SISET, 2009 (raccomandazioni con diversi livelli di evidenza)
ASINTOMATICI
Indicato prima dell’esposizione a situazioni a rischio trombotico particolare (terapia ormonale, gravidanza,
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trombotico particolare (terapia ormonale, gravidanza, ecc.) in soggetti:
� con storia familiare chiaramente positiva per tromboembolia venosa
� familiari di 1° grado di portatori di trombofilia eredofamiliare
Familiari di portatori di
trombofilia eredofamiliare
�Screening completo trombofilico
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�Ricerca delle due mutazioni (Fattore V Leiden e G2021A della protrombina)
Quali alterazioni trombofiliche ricercare
� Difetto di Antitrombina
� Difetto di Proteina C
Difetto di Proteina S
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� Difetto di Proteina S
� Mutazione Fattore V Leiden/Resistenza APC
� Mutazione G20210A della protrombina
� Lupus Anticoagulant e anticorpi antifosfolipidi
Altre alterazioni
trombofiliche/fattori di rischio� Disfibrinogenemia
� Aumento Fattore VIII
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Aumento Fattore VIII
� Iperomocisteina
(opzionale per tromboembolia venosa e complicanze gravidanza, da eseguire per patologia arteriosa)
Proteina C, Proteina S e Antitrombina III
Gli anticoagulanti naturali modulano i processi
emocoagulativi impedendo che essi procedano in
modo eccessivo.
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modo eccessivo.
La carenza congenita è trasmessa come carattere
autosomico dominante ed è correlata ad alto
rischio di manifestazioni trombotiche anche in
giovane età
Proteina C ed S
La proteina C è una glicoproteina di
62 kD, Vitamina K dipendente,
costituita, nella forma matura, da
due catene polipeptidiche. Il
complesso trombina/ trombo-
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modulina attiva in modo ottimale
la proteina C.
Questa, assieme al suo cofattore
specifico la glicoproteina S, che ne
incrementa l'affinità di legame ai
fosfolipidi, forma un complesso
legato alla membrana APC-PS, che
inattiva i fattori Va e VIIIa
La carenza congenita di Proteina C si trasmette come carattere autosomico dominante ad espressività incompleta, con situazioni fenotipicamente diverse a seconda dei livelli plasmatici della proteina.
DEFICIT di PROTEINA C
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fenotipicamente diverse a seconda dei livelli plasmatici della proteina.
Gravissimi deficit, in condizioni di omozigosi, possono provocare la morte, per trombosi diffuse e massive, nei neonati. Nei soggetti adulti il deficit si manifesta con marcate trombosi venose profonde.
DEFICIT di PROTEINA C
� La malattia è geneticamente determinata da delezioni od inserzioni (tipo I con diminuita sintesi di proteina) o da mutazioni non-senso (tipo II con proteina funzionalmente alterata).
� Una particolare resistenza alla APC è stata messa in
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� Una particolare resistenza alla APC è stata messa in evidenza come legata allo stato di eterozigosi o di omozigosi per la mutazione puntiforme nel gene (1q21-25) per il Fattore V, nella posizione 1691 della tripletta che codifica (CGA-CAA) per Arginina 506, sostituita da acido glutamico.
� Questa sostituzione altera il sito di “cleavage” della proteina C sul fattore V (Fattore V di Leiden) e ne impedisce l'inattivazione.
• I dosaggi funzionali si basano sull’attivazione dellaProteina C con Agkistrodon contortrix (Protac®) e sua valutazione come capacità di allungare un aPTT(metodo coagulometrico) o di agire su di un substrato cromogenico (metodo cromogenico)
DOSAGGIO DI PROTEINA C
DOSAGGIO di PROTEINA C
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substrato cromogenico (metodo cromogenico)
• In circa il 30% dei pazienti con APC-resistence i livellimisurati con metodo coagulometrico possono risultarediminuiti (interferenza del fattore V mutante)
DEFICIT di PROTEINA S
La Proteina S, Vitamina K dipendente, è il cofattore necessario all’azione anticoagulante e profibrinolitica della Proteina C attivata. La PS è presente nel plasma in due diverse forme: PS
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La PS è presente nel plasma in due diverse forme: PS libera (40%) e PS legata al C4b-BP (Complement C4b -Binding Protein) (60%). Solo la PS libera è funzionalmente attiva.
DEFICIT di PROTEINA S� Deficit ereditari della Proteina S rappresentano un
importante fattore di rischio di trombosi venose. Sono descritti tre tipi di difetti:
� tipo I = (deficit quantitativo) caratterizzato dalla
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� tipo I = (deficit quantitativo) caratterizzato dalla diminuzione della Proteina S totale e libera circolante;
� tipo II = (deficit funzionale) con normali livelli plasmatici della proteina;
� tipo III = riduzione selettiva dei livelli plasmatici di proteina libera.
• Metodi funzionali
DOSAGGIO DI PROTEINA S
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- Test coagulometrici utilizzanti varianti del PT,dell’APTT
- Evidenziano tutti e tre i tipi di deficit- Non necessaria la separazione della quota libera
In un certo numero di pazienti con APC-resistancesi hanno apparenti riduzioni del livello di
Proteina S
Permettono una valutazione dei livelli di antigene totale e libero nel plasma
- Tecniche immunoelettroforetiche
METODI IMMUNOLOGICI
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- Tecniche immunoelettroforetiche - Tecniche immunoenzimatiche***- Tecniche immunoturbidimetriche***
(automatizzabili sui moderni strumenti per coagulazione)
*** grazie all’utilizzo di anticorpi monoclonali, permettono di misurare direttamente la frazione libera
Carenze di tipo acquisito
Deficit di proteina C di grado variabile siassociano a:� epatopatia con grave difetto di sintesi
� sindrome da coagulazione intravascolare disseminata (DIC)
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� sindrome da coagulazione intravascolare disseminata (DIC)
� sindrome da distress respiratorio dell'adulto
� stato postoperatorio.
Deficit di proteina S può essere riscontrato:� in pazienti in terapia estroprogestinica
� gravidanza
� sindrome da coagulazione intravascolare disseminata (DIC)
Stati di carenza acquisita di Proteina S possono essere correlati ad aumentati livelli plasmatici di proteine della fase acuta dell'infiammazione.
APC Resistance
Risposta anticoagulante alla PC attivata minore rispetto alla
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attivata minore rispetto alla risposta attesa.
L'antitrombina III è un inibitore delle serin proteasi con maggiore affinità per la trombina. Oltre alla trombina è in grado di inibire altre serin proteasi del sistema emostatico, quali i fattori XlI a, Xla, IXa, Xa e Callicreina.
Antitrombina III
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Xla, IXa, Xa e Callicreina.
Il legame tra AT III e trombina è accelerato circa 1.000 volte dalla presenza di eparina e/o sostanze eparinosimili prodotte in vivo dai mastocitidell'apparato gastroenterico e polmonare e presenti a livello della parete vascolare endoteliale
Sono descritti due tipi principali di carenza congenita di Antitrombina III, trasmessi come carattere autosomico dominante:
Tipo I = con diminuita sintesi della
DEFICIT di ANTITROMBINA III
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Tipo I = con diminuita sintesi della proteina;
Tipo II = con sintesi di una proteina funzionalmente incompleta, alterata nel sito di legame con le serin proteasi, oppure in quello di legame con l'eparina, oppure in entrambi
Test funzionali cromogenici
- basati sulla valutazione dell’attività anti-IIa residua di AT III in presenza di eparina
Dosaggio Antitrombina III
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residua di AT III in presenza di eparina
- basati sulla valutazione dell’attività anti-Xa
Test funzionali coagulativi
Valutazione immunologica
Walker ID, Greaves M, Preston FE. Investigation and management of heritable thrombophilia. Br J Haematol 2001; 114: 512-28
Tromboembolismo venoso > 90% dei casiTrombosi venose profonde arti inferioriEmbolia polmonare
MANIFESTAZIONI CLINICHE NEI PAZIENTI CON
TROMBOFILIE EREDITARIE
DA DEFICIT DI PROT C, PROT S e ATIII
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Embolia polmonareTromboflebiti superficialiTrombosi delle vene mesentericheTrombosi delle vene cerebrali
Primo episodio di trombosi di solito prima dei 40 anni: Frequenti recidive, Familiarità
Quali test eseguire
� Antitrombina (dosaggio funzionale cromogenico)
� Proteina C (dosaggio funzionale cromogenico)
� Proteina S (immunologico della frazione libera)
� Resistenza PC attivata o mutaz. Fattore V Leiden
� Mutaz. G20210A della protrombina
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� Ricerca LAC
� Dosaggio anticorpi anticardiolipina e anti β2 Glicoproteina I (IgG ed IgM)
� Omocisteina
Raccomandati anche PT, aPTT ed emocromo completo
Quali test eseguire
� Proteina C (dosaggio funzionale coagulativo)
� Proteina S (dosaggio funzionale coagulativo, se usato come test di 1° livello necessaria una conferma con
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come test di 1° livello necessaria una conferma con test immunologici della frazione libera)
� Dosaggio immunologico di Antitrombina, Proteina C e Proteina S totale (per tipizzazione difetti)
� Fattore VIII
Quando NON eseguire i test�Trombosi acuta (eseguire la diagnostica per HIT,
se presente sospetto)�Durante le terapie anticoagulanti�Gravidanza o terapia ormonale� In tutte le condizioni associate ad aumento
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� In tutte le condizioni associate ad aumento delle proteine della fase acuta (post-chirurgia, malattie infiammatorie)
Se indispensabile, test genetici sempre eseguibili, ma in genere non sono consigliabili screening parziali
Quando eseguire i test
�Dopo 3 mesi dall’evento trombotico venoso/arterioso
�dopo almeno 48 ore dalla sospensione di eparina e derivati
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eparina e derivati�Dopo 30 giorni dalla sospensione della
terapia anticoagulante orale�Dopo almeno 2 mesi dal parto�Dopo almeno 1 mese dalla sospensione
della terapia ormonale
Modificazioni aspecifiche dovute a:
�Evento acuto
�Terapia eparinica
� Riduzione AT, PC, PS, Omocys; Aumento FVIII
� Riduzione AT; Interferenza su dosaggio PC, PS, test APCR e ricerca LAC
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�Anticoagulanti orali
�Gravidanza
�Estroprogestinici
test APCR e ricerca LAC
� Riduzione PC e PS; Interferenza su test APCR
� Riduzione PS, Omocys; Aumento PC e FVIII Alterazione test APCR
� Riduzione PS, Omocys; Aumento FVIII Alterazione test APCR
Alterazioni acquisite che possono
determinare false negatività
Mancata diagnosi di carenza di Proteina C
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Gravidanza e trattamento ormonale, sindrome nefrosica, diabete e cardiopatia ischemica
IPEROMOCISTEINEMIA
� Fattore di rischio per eventi trombotici arteriosi e venosi e patologie cardiovascolari
� Negli ultimi anni numerosi studi hanno dimostrato che un aumento moderato di
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dimostrato che un aumento moderato di omocisteina nel sangue si associa a malattie vascolari precoci
Richiesta test non appropriati/non necessari
NON RICHIEDERE:
Dosaggi coagulativi Fattore V e II
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RICHIEDERE:
MUTAZIONE DEI FATTORI V e II
Conferma di una alterazione�Valutare se l’esame è stato eseguito secondo
i canoni dell’appropriatezza�Ripetere dosaggio AT, PC e PS in caso di
valori alterati su un nuovo campione, eventualmente con altra metodica
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eventualmente con altra metodica�Ripetere i test per LAC, ACA e anti β2 GPI
dopo almeno 12 settimane�Ripetere omocisteina/eseguire mutazione
MTHRF�Ripetere aPCR/eseguire mutazione Fattore V
Leiden
• danno economico ed organizzativo:� l’esame poteva essere evitato� se non corretto, l’esame deve essere ripetuto
Inappropriatezza
della richiesta e sue conseguenze
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� se non corretto, l’esame deve essere ripetuto
• ancor più grave: possibilità di risultati falsi positivi, falsi negativi e difficoltà d’interpretazione per il clinico
INAPPROPRIATEZZA
della richiesta e sue conseguenze
• non è possibile una valutazione critica del Laboratorio al momento dell’accettazione (assenza di informazioni anamnestiche)
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• in genere il Laboratorio si accorge dell’inappropriatezza solo al momento della refertazione quando il dosaggio è già stato eseguito (indici di flogosi alterati, βHCG positivo…); altre volte non vi è nemmeno questa possibilità
Ricordare
Siamo in grado di identificare la trombofilia in circa un terzo/la
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trombofilia in circa un terzo/la meta’ dei pazienti con trombosi