Date post: | 01-Jul-2015 |
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Funghi opportunisti
PATOGENI OPPORTUNISTI
Absidia corymbiferaAspergillus fumigatus
Candida albicansCrytococcus neoformans
Pneumocystis cariniiRhizomucor pusillus
Rhizopus oryzae (R.arrhizus)
Candida Candida albicansalbicansè un fungo dimorfico
CANDIDOSI
• Provocate da Candida albicans e altre candidaspp. che costituiscono la normale flora nellabocca, sulla pelle, nella vagina e nell’intestino
• Può manifestarsi in seguito a trattamenti conantibiotici che sopprimono la normale florabatterica e ne permettono una crescita maggiore
Infezioni sistemicheInfezioni sistemiche dadaCandidaCandida si manifestano si manifestano
• In pazienti fortemente debilitati (es. cancro)• In diabetici• In pazienti sottoposti a chemioterapia• Soggetti sottoposti a trapianto
(immunosoppressi)• Nei leucemici• Nei malati di AIDS
Terapia orale-fluconazolo etc
La transizionelievito ifelievito ife
•Aumento della temperatura (25° → 37°C)
•Aumento del pH del mezzo (acido → basico)
•Limitazione dei nutrienti (es. glucosio)
•Siero
in vitro viene indotta da:
IFE: pH 7.0 / 37°C
GERM TUBES
4-6 MICRONS
Pseudoifa
Clamidospore
DIAGNOSI di Candida albicans
1. Osservazione macroscopica
Colonie: inizialmente bianche, cremose, brillantipoi diventano rugose
• Candida: piastra dopo 24 ore
2. Osservazione microscopica
• Forma:rotondeggiante - ovale
• Blastospore• Presenza di Pseudoife
3. Tests specifici
• Test di blastèse:Mette in evidenza i tubi germinativi: filamenti che si formano
a partire dalle blastospore (nessun restringimento allabase)
• Ricerca di clamidospore:Spore (endosporulazione) sferiche o ovali prodotte in
condizioni avverse.
3.1. Test di blastèse:
Coltura liquida
1 mlsiero
Agitare
Incubare 3h a37°C
3.2. Ricerca di clamidospore
Una goccia di coltura
Terreno a base di mais
Mettere un vetrino
Incubare 24 - 48h a 28°C
Guardare almicroscopio
Isolamento Isolamento in in Candida Candida albicansalbicansdi geni differenzialmentedi geni differenzialmente
espressi medianteespressi mediante DDRT-PCRDDRT-PCR
Isolamento di geni differenzialmenteIsolamento di geni differenzialmenteespressi medianteespressi mediante DDRT-PCRDDRT-PCR
Omologia di CaGS Omologia di CaGS con con trasportatoritrasportatorie e sensori di glucosiosensori di glucosio
Identità Similarità Tipo di proteina Organismo
47% 67% Snf3p S.cerevisiae 46% 67% Rgt2p “ 47% 65% Rag4 K.lactis 44% 61% Rco3 N.crassa 35% 59% Hxt2 S.cerevisiae 33% 60% CaHgt1 C.albicans
E’ presente la sequenza consensus tipica dei trasportatori e sensoriper il glucosio: 334-[-G-I-i-l-V-E-t-W-G-R-R-p-l-l-m-a-g-S-]-351
Distruzione Distruzione del gene del gene mediante mediante lalatecnica della tecnica della cassettacassetta
PstIPstI
URA3
PCR2
AflII
HisG
null mutant
ura -/-
ATG TAA
CaGS
PstI
AflIII
Reinserimento Reinserimento del gene del gene CaGSCaGS nel nel locuslocus di originedi origine
Analisi per Northern
Analisi per Analisi per SouthernSouthern
CAI12 T1 T3 T5
CaGS1600 nt
A
B
rRNA
Analisi Analisi del del fenotipofenotiposu piastrasu piastra
CAI12 T1etero
T3null
T5revert
YNB/2% gl.+ 10% siero
YNB/0.1%gl.+ 10% siero
H2O+ 10% siero
M0199pH 7.5
Infezione dei macrofagiInfezione dei macrofagi
CAI12 T1 T3
Aspergillusspecie (185), raccolte in ben 18 gruppimuffe ubiquitarie
Aspergillus fumigatus
Ife settate di A. fumigatusche si diramano
dicotomicamente in uncampione di tessuto
Aspergillus fumigatusPuò riprodursi fino a 50°C : uccelli infezionimortali (in particolare A. fumigatus).
Nei rifiuti organici quando la T ↑, gliaspergilli coltura pura.
miceli simili a polvere verde-bluastro:fumigatus (latino fumoso).
I conidiofori lunghezza di 500um, conidiformano catene parallele verdastri(Aspergillus in latino significa spazzola)
Aspergillosi
Aspergillosi
L’invasione del tessuto polmonare è limitata a soggetti immunodepressi.
Aspergillus fumigatus
•dimensioni del tallo fungino maggiori di quelle dellecellule fagocitarie
•dimensioni della spora 2 a 3 µm
•l’energia meccanica del conidio in germinazione
•Micotossine
Fattori di Virulenza
Micotossine
Le micotossine (un gruppo di circa 100 sostanze)metaboliti secondari di alcuni funghi filamentosi
Aspergillus sp Penicillium sp Fusarium sp
Alimenti per lattanti e prima infanziaAlimenti per lattanti e prima infanzia Regolamento N. 683/2004
aflatossina B1 0,10 µg/kg
aflatossina M1 0,025 µg/kg
ocratossina A 0,50 µg/kg
TERAPIA
Il trattamento con Amfotericina B è incoraggiante.
Aspergillosi
Una sostanza antifungina ottimaledovrebbe avere...
• Un ampio spettro di attività• Proprietà farmacocinetiche
ottimali• Adeguata efficacia in vivo• Bassa tossicità• Basso costo
HOST
DRUG
FUNGUS
• Amphotericin B• Nystatin• Ketoconazole• Fluconazole• Itraconazole
Al momento esistono solo Fungistatici Tossici
se somministrati per lunghi periodi
CandidaCandida è in è in grado grado didi sopravvivere sopravvivereadattandosi agli ambienti più ostiliadattandosi agli ambienti più ostili,,
come come quello allquello all’’interno interno deidei macrofagi macrofagi
•Regolazione dell’espressione genica
•Secrezione di proteinasi (SAP)
•Produzione di ife
Isolamento di geni differenzialmente espressidurante l’infezione dei macrofagi
Studio della funzione dei geni isolati, perpoter individuare potenziali antifungini sui prodottiproteici
Amphotericin BMeccanismo di Azione
Azoles
• Azoles
• Causes Inhibition ofC-14 α demethylase,(an enzyme requiredfor the synthesis ofergosterol) by bindingto cytochrome P450
Imidazoles Triazoles
Imidazolo
Allyamines
• Inhibits squaleneepoxidase, an enzymeessential for synthesisof ergosterol
• Drug acculmulates innails, skin and fat
• Very useful for nailinfections
Polyenes
• Amphotericin, nystatin• Antifungal activity by
binding to membranesterols such asergosterol and theyincrease membranepermeability and leadsto cell death
Amphotericin Bè in uso clinico dal 1960
• Un poliene macrolide• Isolato dallo
Streptomyces nodosus• Insolubile in acqua• Solubilizzato in sodio
deossicolato
Amphotericin Bé attiva in vitro contro
• Candida spp.(incluse le specie azolo-resistenti)
• Aspergillus spp.• Cryptococcus neoformans• Mucor spp.• Blastomyces dermatitidis• Coccidioides immitis• Histoplasma capsulatum• Paracoccidioides brasiliensis
Ridotta suscettibilità(resistenza) all’ amphotericin B
• C. lusitaniae• C. krusei• C. neoformans• Trichosporon spp.• A. terreus
Walsh et al. JCM 1990; 28: 1616Sutton et al. JCM 1999; 37: 2343Arikan et al. JCM 1999; 37: 3946Arikan et al. JCM 2002; 40: 1406
• S. apiospermum• Fusarium spp.• C. carrionii• F. pedrosoi• ...
Resistenza all’ Amphotericin B
• Resistenza all’ amphotericin B èfrequentemente osservata in vivo
• Generalmente è dovuta ad una riduzionedell’attività del sistema immunitario
Amphotericin B
Amphotericin B è tossica
Effetti collaterali dell’ AmB
Nefrotossicità
Disfunzioni epatiche
Anemia,..