Proteomicadisciplina che studia
l’espressione delle proteine
le interazioni tra proteine
la struttura delle proteine
Espressione delle proteine
METODI DI ANALISI
Elettroforesi su gel
Tecniche immunologiche
Western blot
Analisi in situ
ELISA
Elettroforesi su gelSDS PAGE
Elettroforesi su gelbidimensionale
Focalizzazione isoelettrica
2D SDS PAGE
Fonti di errore del 2D SDS PAGEnella quantizzazione delle proteine:
• Estrazione non stechiometrica delle proteine dai vari costituenti cellulari
• Mancata migrazione delle proteine nel gel di focalizzazione
• Risposta non lineare del colorante di rivelazione
Sono poco rappresentate le proteine con alta carica e bassa concentrazione oppure quelle sequestrate in organelli o membrane
Le proteine molto grandi migrano male in SDS, quelle molto piccole possono uscire dal gel
Strategie per evidenziare anche le proteine meno abbondanti:
• “tagging”delle proteine meno abbondanti con biotina-avidina (es. proteine di membrana)
• eliminazione delle proteine più abbondanti mediante cromatografia per affinità
Database di gel 2D
DI GEdiff erential in gel electrophoresis
http://ca.expasy.org/melanie
MALDI-TOF-MS(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight-Mass Spectrometer)
Identificazione delle proteineSpettrometria di massa
HP
AG
CC V A D
LF
FE
K
H P A G C C
V A D
L FF
EK
tripsina
Tecniche immunologichestruttura e produzione di anticorpi
Anticorpi policlonali
Tecniche immunologicheProduzione di anticorpi monoclonali
Tecniche immunologiche
Gel di poliacrilamide colorato con coomassie
Filtro dopo reazione antigene-anticorpo e successiva rivelazione
WESTERN BLOT
ELISA con antigene adsorbito sulla piastra
Immunoistochimica
Marcatura immunitaria con oro(microscopia elettronica)
MI CROARRAY DI PROTEI NE
Network delle interazioni tra proteine nel lievito
- PHAGE DI SPLAY
- DOPPI O I BRI DO:
ESI STONO DIVERSE METODICHE PER SELEZI ONARE LI GANDI DI UNA PROTEI NA DI I NTERESSE: ?
“TRAPPI NG” -> MASS SPEC. ?
- FRET
Doppio ibrido
MODI FI CAZI ONE DEL CAPSI DE FAGI CO
BATTERI OFAGOBATTERI OFAGORI COMBI NANTE
LI BRERIE DI cDNA SU FAGO ( PHAGE DI SPLAY)
GENE PROTEINA CAPSIDICA
c DNA
CLONAGGIO
PRODOTTI DI c DNA
- PHAGE DI SPLAY:
?
LIBRERIA
?
LIBRERIA DI FAGIRICOMBINANTI( 108-109 PLACCHE)
SEQUENZA GENERICOMBINANTE
IDENTI TA’ DEL PEPTIDE ESPOSTO
?bait
SELEZIONE PER AFFINITA’
POTENZIALI LIGANDI DELLA PROTEINABERSAGLI O DELLA SELEZI ONE
FRET(Fluorescent Risonance Energy
Transfer)