PseudomonasPseudomonas

Famiglia Pseudomonadaceae

Pseudomonad significa letteralmente Falsa unità, pseudo (falso) monad (singola unità)

Biofilm piuttosto che forma planctonica

http://www.youtube.com/watch?v=ghwoPwJm-D8

PseudomonasPseudomonas•Bastoncelli diritti o debolmente ricurvi

•Dimensioni 0,5-1,0 x 1,5-5,0m

•Gram negativi

•Aerobi obbligati

•non fermentanti

•Mobili (uno o più flagelli polari)

•Asporigeni

•Ossidasi e Catalasi positivi

•Temperature tra 4 e 42°C

•Colonie morfologia simile a un uovo fritto (larga, liscia e

con il centro rialzato).

PseudomonasPseudomonas

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PseudomonasPseudomonas

PseudomonasPseudomonas

PseudomonasPseudomonas

Più di 140 specie, molte delle quali sono saprofitiche

Più di 25 specie possono causare infezioni opportunistiche

Tra queste vi sono P. aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, P. cepacia,

P. stutzeri, P. maltophilia e P. putrefaciens

Circa l’80% delle Pseudomonas isolate da campioni clinici:

aeruginosa e maltophilia

PseudomonasPseudomonasMicrorganismi ubiquitari, si trovano:• suolo • materiale organico in decomposizione • vegetazione • acqua• fiori recisi• lavandini• toilette• strofinacci da pavimento• attrezzature per dialisi • respiratori di terapia intensiva• soluzioni disinfettanti a base di ammonio

quaternario

PseudomonasPseudomonasDifficile da debellare Prevalentmente un opportunista

Semplici esigenze di crescita:Semplici esigenze di crescita:

degrada un’ampia gamma di composti difficilmente

metabolizzabili da altri microrganismi.

Cresce in presenza di elevate concentrazioni di sale, blandi

detergenti, coloranti, e in presenza degli antibiotici più

comunemente utilizzati.

Temperatura ottimale tra i 20°e i 30°C, ma replica (più

lentamente) anche tra 0° e 4°C (partecipa alla degradazione dei cibi

conservati in frigorifero)

Resistente ai detergenti

Forma biofilm che aderiscono a diversi tipi di materiali

Pseudomonas Pseudomonas aeruginosaaeruginosa FATTORI DI

VIRULENZA Componenti strutturaliAdesine

Capsula polisaccaridica

EnzimiElastasi

Fosfolipasi CPiocianina

TossineEndotossinaEsotossina AEsoenzima S

 La virulenza di P.aeruginosa è multifattoriale

ADESINEL’adesione è mediata da pili e da adesine non piliari

Quasi tutti i ceppi presentano un solo flagello polare che conferisce

motilità, ma permette anche l’adesione a recettori presenti sulla

membrana plasmatica delle cellule eucariotiche.

La diffusione del batterio è facilitata dalla presenza di

PILI in grado di ritrarsi permettendo a P. aeruginosa di muoversi

(twitching) su superfici semisolide o leggermente idratate.

P.aeruginosa produce neuramminidasi che rimuove i residui

di acido sialico dai recettori dei PILI di adesione aumentando

l’adesione alle cellule epiteliali

COMPONENTI STRUTTURALI

CAPSULA POLISACCARIDICA Costistuita prevalentemente di

ALGINATO, un esopolisaccaride mucoide costituito da polimeri

ripetuti di acido mannuronico e guluronico.

Favorisce l’adesività alla superficie di protesi vascolari e formare

BIOFILM

Viene persa durante la crescita in vitro

In pazienti con fibrosi cistica il batterio sovra-produce alginato

che lo protegge dalla fagocitosi e dall’azione degli antibiotici.

Pseudomonas Pseudomonas aeruginosaaeruginosa

COMPONENTI STRUTTURALI

Pseudomonas Pseudomonas aeruginosaaeruginosa

Pigmenti diffusibili:

– fluoresceina (gialla)

– piorubina (fenilazina marrone-ruggine)

– piomelanina (nero) 

– piocianina (blu)

– pioverdina (verde-giallo fluorescente)

Pseudomonas Pseudomonas aeruginosaaeruginosa

Le PIOVERDINEPIOVERDINE (più di 40 strutturalmente differenti) sono i siderofori più

utilizzati dagli Pseudomonas fluorescenti.

Sono pigmenti giallo-verdi, fluorescenti, chelano Fe+3, (cofattore per

l’attività catalitica di molti enzimi).

La pioverdina secreta da P. aeruginosa regola la produzione di almeno 3

fattori di virulenza: Esotossina A, una endoproteasi e la pioverdina

stessa.

PIOCIANINAPIOCIANINA: metabolita secondario di colore blu, formazione di pus blu.

In latino aeruginosa: verderame infatti il batterio presenta un colore verde-blu.Con azione antibiotica, su S. aureus o E. coli (antagonismo microbico).

Essendo uno zwitterione, penetra facilmente attraverso la membrana

plasmatica nelle cellule eucariotiche, ed è in grado di interrompere la

respirazione cellulare.

Pseudomonas Pseudomonas aeruginosaaeruginosa

FATTORI DI VIRULENZAFATTORI DI VIRULENZA

http://www.youtube.com/watch?v=5yGbxyOpZRk

Esotossina AEsotossina A formata da due frammenti A (Active) e B (Binding)

uniti da ponte S-S. Il frammento B si lega al recettore CD91 della

cellula ospite e permette l’ngresso del frammento A nella cellula.

Quest’ultimo, essendo una ADP-ribosil-transferasi va a inibire il

fattore di elongazione EF-2 e quindi la sintesi proteica con

conseguente morte della cellula ospite con azione simile alla

tossina difterica

Responsabile:• della necrosi tissutale nelle ustioni • dell’insufficienza respiratoria nelle infezioni polmonari

Pseudomonas Pseudomonas aeruginosaaeruginosa

FATTORI DI VIRULENZAFATTORI DI VIRULENZA

ElastasiElastasi

Elastasi B una zinco-proteasi secreta nello spazio extracellulare

dove distrugge l’elastina e altre proteine della matrice polmonare.

Elastasi A una proteasi serinica con una potente attività anti-

stafilococcica (competizione microbica), ma meno attiva nel

degradare l’elastina. Entrambe le elastasi contribuiscono alla

distruzione del tessuto polmonare, causando emorragie polmonari

associate a infezioni da P. aeruginosa.

Pseudomonas Pseudomonas aeruginosaaeruginosaFATTORI DI VIRULENZAFATTORI DI VIRULENZA

SS3T tipico dei batteri patogeni gram-negativi,

considerato il fattore di virulenza principale di P. aeruginosa. Attivato dal

contatto con le cellule eucariotiche e da condizioni ambientali, come la

concentrazione calcio.

Formato da 3 componenti: l'apparato di secrezione, l'apparato di

traslocazione e le tossine:

ExoS e ExoT: riarrangiano la struttura del citoscheletro e inibiscono la

fagocitosi

ExoU: ha un'attività fosfolipasica nel giro di 1-2 ore, distrugge la membrana

plasmatica della cellula ospite inducendo la necrosi

ExoY: porta ad un riarrangiamento del citoscheletro actinico

Inibizione della fagocitosi e un aumento della permeabilità endoteliale.

Pseudomonas Pseudomonas aeruginosaaeruginosaQuasi tutti i ceppi di Pseudomonas producono le tossine ExoT ed ExoY,

ma non tutti codificano per una ExoY funzionale a causa della presenza di mutazioni frame-shift. ExoS ed ExoU non sono prodotte quasi mai dallo stesso ceppo. Sulla base delle diverse tossine prodotte, i ceppi di P. aeruginosa vengono suddivisi in due gruppi: i produttori di ExoS/ExoT ed i produttori di ExoU/ExoT.

sia ExoS che ExoT si associano, transitoriamente, a regioni di membrana ricche in colesterolo.

Le conseguenze della distruzione del citoscheletro a opera delle due tossine sono varie, tra cui la formazione di cellule arrotondate con una

•diminuita aderenza cellula-cellula (che facilita la penetrazione di P. aeruginosa attraverso la barriera epiteliale),

•inibizione della fagocitosi,

•blocco della migrazione cellulare (associata al ritardo nella guarigione delle ferite)

•infine la morte cellulare.

Pseudomonas Pseudomonas aeruginosaaeruginosaFATTORI DI VIRULENZAFATTORI DI VIRULENZA

Sistema di secrezione di tipo III tipico dei batteri patogeni gram-

negativi,

considerato il fattore di virulenza principale di P. aeruginosa. È

attivato dal contatto con le cellule eucariotiche e da condizioni

ambientali, come la concentrazione calcio.

Formato da 3 componenti: l'apparato di secrezione, l'apparato di

traslocazione e le tossine:

ExoS e ExoT: riarrangiano la struttura del citoscheletro e

inibiscono la fagocitosi [

ExoU: ha un'attività fosfolipasica

ExoY: porta ad un riarrangiamento del citoscheletro actinico

Pseudomonas Pseudomonas aeruginosaaeruginosapuò muoversi con 3 diversi meccanismi:

• Swimming: avviene in una fase liquida tramite un unico flagello

polare.

• Twitching: forma di traslocazione batterica indipendente dal flagello

che avviene su superficie umide. Tramite l'estensione e l'accorciamento

dei pili di tipo IV, le cellule della colonia batterica si espando

concentricamente con velocità di 1 mm/h.

• Swarming (sciame): tipico di un gruppo di pesci, uccelli, insetti o

microorganismi che si muovono insieme nella stessa direzione

P. aeruginosa utilizza questo tipo di movimento su superfici semi-solide

in risposta ad una carenza di azoto e in presenza di alcuni amminoacidi.

Diversamente dallo swimming Il batterio esprime due flagelli ai rispettivi

poli della cellula inoltre sono necessari anche i pili di tipo IV. La colonia

assume delle forme caratteristiche.

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Twitching Swarming

Per lo swimming che per il twitching è stata dimostrata una

risposta chemiotattica ad un ampio spettro di composti.

Gli attrattori o repulsori sono riconosciuti da 26 diversi recettori chemiotattici

BIOFILMBIOFILMFattore di virulenza molto importante, e contribuisce

significativamente alla resistenza a molte delle terapie antibiotiche.

I biofilm sono comunemente definiti come una comunità ben

strutturata di batteri e cellule eucariotiche, racchiuse in una

matrice polimerica prodotta dalle cellule stesse, che cresce su

una superficie (biologica o inerte), in particolare all'interfaccia con

una fase liquida.

Sebbene la maggior parte dei biofilm siano eterogenei (composti

da diverse specie), P. aeruginosa generalmente forma un biofilm

monospecie, in particolare questo avviene durante le infezioni

croniche nella fibrosi cistica

Pseudomonas Pseudomonas aeruginosaaeruginosa

Il processo di formazione di un biofilm può essere schematizzato in 6 fasi:

1. Forma planctonica

2. Attacco reversibile

3. Attacco irreversibile

4. Formazione delle microcolonie

5. Maturazione

6. Dispersione

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BIOFILMBIOFILM

In laboratorio P. aeruginosa può formare due tipi di biofilm:

biofilm piatto e biofilm strutturato

In entrambi i casi i batteri, inizialmente, aderiscono reversibilmente a una superficie, ma solo dopo che l’adesione diviene irreversibile inizia la colonizzazione e la formazione del biofilm.

Nel caso del biofilm strutturato si formano complesse strutture tridimensionali dette stalks (steli) e towers (torri).

I ceppi che sovra-producono alginato formano un biofilm con un’architettura altamente strutturata, e sono molto più resistenti alla tobramicina

Pseudomonas Pseudomonas aeruginosaaeruginosa

FATTORI DI VIRULENZAFATTORI DI VIRULENZA

Quorum-sensing

L’espressione, la produzione e la secrezione di molti di

questi fattori di virulenza (codificati da circa 350 geni, cioè

circa il 6% del genoma di P. aeruginosa) è regolata da un

processo di comunicazione e densità cellulare,

denominato (QS). La comunicazione cellula-cellula avviene attraverso le

molecole segnale omoserina lattone che sono secrete, accumulate

nell’ambiente extracellulare e nel momento in cui raggiungono una

concentrazione elevata (che naturalmente, aumenta al’aumentare delle cellule

batteriche) sono adsorbite dai batteri nei quali regolano la trascrizione di diversi

geni i cui prodotti sono fattori di virulenza.

Pseudomonas Pseudomonas aeruginosaaeruginosa

Crescere fino a 42°C

Aerobio obbligato,

alcuni ceppi crescono in anaerobiosi grazie alla denitrificazione.

P. aeruginosa può colonizzare qualsiasi tipo di tessuto dando origine a infezioni opportunistiche (endocarditi, polmoniti, infezioni delle vie urinarie, della pelle ecc.) che nel 50% dei casi portano a morte.

L’80% dei pazienti con fibrosi cistica muore a causa di infezioni polmonari, acute o croniche, provocate da P. aeruginosa, che causa la distruzione del tessuto polmonare.

La diffusione avviene attraverso il contatto con aerosol o per ingestione di cibo o acqua contaminati.

FIBROSI CISTICA

• Malattia genetica autosomica recessiva

• Perdita della regolazione trans-membranaria dei canali del Ca++ sulla membrana apicale delle cellule epiteliali e conseguente elevato contenuto salino nei fluidi di superficie

• Il sale inibisce l’attività di AMP e di proteine coinvolte nel meccanismo dell’immunità

MANIFESTAZIONI CLINICHEMANIFESTAZIONI CLINICHE

E’ fondamentalmente patogeno nosocomiale, sostenendo il 20-40% di tutte le infezioni contratte in tale sede, mentre è responsabile solo del 3-6% delle infezioni comunitarie.

infezioni polmonariinfezioni polmonari frequenti in soggetti compromessi e con alterazioni anatomo-funzionali dei polmoni

sovrainfezioni in pazienti affetti da:sovrainfezioni in pazienti affetti da: bronchiti acute fibrosi cistica (la produzione di muco vischioso facilita le infezioni ad opera di ceppi che sintetizzano un glicocalice di arginato).

MANIFESTAZIONI CLINICHEMANIFESTAZIONI CLINICHE

complicanza di ustionicomplicanza di ustioni P. aeruginosa può contaminare le superfici esposte con conseguente disseminazione sistemica per via ematica

infezioniinfezioni ferite chirurgiche o ulcere da decubito

otiti esterne e otiti medieotiti esterne e otiti medie fattore predisponente per l'otite esterna è la presenza di acqua nel canale auricolare, pertanto tale affezione è chiamata "otite del nuotatore"

setticemiasetticemia dovuta sovente a cateterizzazione, temibile in pazienti immunodepressi, oncologici, chirurgici

e nei neonati prematuri

MANIFESTAZIONI CLINICHEMANIFESTAZIONI CLINICHE

endocarditiendocarditi nei tossicodipendenti o a seguito di manovre chirurgiche infezioni del SNCinfezioni del SNC (meningiti e ascessi cerebrali) per introduzione del microrganismo in seguito a puntura lombare o operazioni neurochirurgiche infezioni oculariinfezioni oculari caratteristica è" l'ulcera corneale" causata da eventi abrasivi o interventi chirurgici infezioni urinarieinfezioni urinarie in seguito a misure strumentali eseguite a scopo diagnostico o terapeutico

TERAPIATERAPIA

Diffusissimi i ceppi multiresistenti per la presenza di plasmidi codificanti i caratteri di resistenza verso i farmaci. La terapia è in continua evoluzione. Infezioni comunitarie fluorochinoloni cefalosporine di terza generazione (ceftazidime,ceftriaxone etc.) infezioni nosocomiali aztreonam o penicillina anti-Pseudomonas+ aminoglicoside (effetto battericida sinergico) carbapenemici (imipenem, meropenem) N.B. La scarsa sensibilitàR di P. aeruginosa ai piùR comuni antibiotici fa si che il suo sviluppo venga favorito da qualsiasi trattamento antibatterico che riduca la concorrenza della restante popolazione microbica

Pseudomonas Pseudomonas aeruginosaaeruginosa

DIAGNOSI DI LABORATORIODIAGNOSI DI LABORATORIO

P. aeruginosa cresce nei comuni terreni di coltura formando

colonie grandi, sfrangiate, emananti un tipico odore di frutta

Utile l’utilizzo di terreni selettivi a base di cetrimide (lo

Pseudomonas cresce in presenza del disinfettante).

Pseudomonas

Gram negativeGrows in minimal nutrient media

Glowing blue-green colonies under UV