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Acidi nucleici “artificiali”: strumenti chimici per la biologia Prof. Roberto Corradini - Università di Parma Istituto “Fermi” Mantova, 12 Dicembre 2011
Acidi nucleici “artificiali”: strumenti
chimici per la biologia
Prof. Roberto Corradini - Università di Parma
Istituto “Fermi” Mantova, 12 Dicembre 2011
http://www.chimica2011.it/
http://lschimica.unipr.it
http://www.progettolaureescientifiche.eu/
http://www.chemistry2011.org
Chimica
Studia la composizione della materia a partire dalle particelle più semplici (atomi)
Studia la diversità degli atomi
Studia il modo in cui gli atomi si uniscono per formare molecole
Studia le proprietà delle molecole
Studia il modo di trasformare le molecole
Studia il ruolo delle molecole negli organismi viventi
BIOLOGIA MOLECOLARE
1953-Scoperta della struttura del DNA da parte di Watson e Crick
Primi anni ‘60-decodifica del codice genetico
Primi anni ’90 lancio del progetto genoma
2000 completamento del sequenziamento del genoma umano
POST-GENOMIC ERA
CHIMICA DI SINTESI
1955-prima sintesi di DNA artificiale
Anni ‘60-sintesi in fase solida-sintesi di oligomeri
Anni ‘70-ottimizzazione della sintesi chimica
Anni ’80-Automazione
Anni ’90-Produzione commercialeVarie modificazioni disponibiliDNA
POST-GENOMIC ERARNA e DNA di sintesi sono strumenti comuni
Nucleobase
fosfato
Zucchero (ribosio o deossiribosio)
O
OOH
Base
O
OO P
O
O
Base
O
OO P
O
O
Base
RR
R
R = H, OH
N N
NN
NH2
N
N
O
NH2
N N
NNH
O
NH2 N
NH
O
O
N
NH
O
OAdenina (A) Citosina (C) Guanina (G) Timina (T)
Uracile (U)
ACIDI NUCLEICI
DNA, RNA
Complementarietà delle basi
O
O
O
NN
O
O
HNO
N
N
O
N
N
O
H
H
O
OO N
N
N
N
O
N
H
H
H
O
O
O
N
N
N
O
H
H
A T
G C
Legami a idrogeno
A
A
G
G
C
T
T
C
C
G
A
A
G
G
C
T
T
C
C
G
Filamenti con sequenze
complementariDoppia elica
A
A
G
G
C
G
G
T
A
T
Non si forma
(è meno stabile)
Filamenti con sequenze
Non complementari
IL DNA FUNZIONA DA “STAMPO” PER LA
SINTESI DI DNA O RNA
COMPLEMENTARE SEGUENDO QUESTO
SCHEMA
Le basi del DNA funzionano
come lettere di un codice che
può essere “letto” in base alla
complementarietà
SOLCO MAGGIORE
SOLCO MINORE
Coppie di basi
Scheletro ribosio-fosfato
Passo dell’elica: 10 coppie di basi
Distanza fra le coppie di basi 3.4 Å
Diametro esterno: 20 Å
Funzione di DNA e RNA
DNA a doppia elica
mRNA
Proteine
Conservazione
dell’informazione genetica
Espressione
dell’informazione genetica
Molecole funzionali (fenotipo)
SEQUENZA DI BASI
SEQUENZA DI BASI
SEQUENZA DI AMMINO ACIDI
SEQUENZA DI BASIReplicazione
Trasmissione dell’informazione genetica
alle generazioni successive
Trascrizione
Traduzione
Non tutti i geni vengono espressi : Nature ou nurture?
O
OH
O
BaseGU
O
O
O
PO
Base
PG
Sintesi di DNA
O
O
O
O
PO
Base
PG
O
O
O
O
PO
Base
PG
O
O
O
O
O
PO
Base
H
O
GU
O
O
O
PO
Base
PG
O
O
O
O
PO
Base
PG
O
O
O
O
PO
Base
PG
O
O
O
O
O
PO
Base
H
O
O
O
O
P OO
Base
O
O
OH
Base
O
OH
O
P OO
Base
OPERAZIONI RIPETUTE CICLICAMENTE: SI PRESTA AD AUTOMAZIONE
SINTESI AUTOMATICA
OLIGONUCLEOTIDI (DNA) COMMERCIALI
E-mail order
Operatore
Controllo di qualità
Purificazione
Certificazione
Spedizione
Consegna
entro due giorni
Acidi nucleici di sintesi
Si possono sintetizzare frammenti di DNA contenenti fino a 150 basi
Il genoma umano contiene circa 3 miliardi di coppie basi.
LA TECNOLOGIA DI SINTESI DEL
DNA (O RNA) PERMETTE DI
PRODURRE EFFETTI A PARTIRE DA
SEQUENZE NON PRESENTI IN
NATURA E DI AVERE A
DISPOSIZIONE DNA PER
APPLICAZIONI TECNOLOGICHE O
PER PRODURRE BENI/SERVIZI
CHE IN NATURA NON ESISTONO
“Vita artificiale”
DNA
O
O
O
P OO
Base
Phosphorothioate
O
O
O
P OS
Base
2-O-alkyl-RNA
O
O
O
P OO
Base
OR
Locked Nucleic
Acid (LNA)
O
O
O
P OO
Base
O
Phosphoramidate
O
O
NH
POO
Base
ANALOGHI DI OLIGONUCLEOTIDI
Morpholino
N
O Base
PO
O
N
O
NH
N
O
B
O
n
O OP
O
B
O
O n
** *
*
DNA PNA
Nielsen PE, Egholm M, Berg RH,
Buchardt O. Science 1991; 254; 1497-
1500
ACIDI PEPTIDO NUCLEICI (PNA)
NH
N
O
B
O
n
O OP
O
B
O
O n
** *
*
DNA PNA
Formano con il DNA doppie eliche molto più stabili di
quelle naturali
Sono in grado di formare doppie eliche completamente
artificiali PNA:PNA
Sono in grado di distinguere meglio del DNA mutazioni
delle basi
Sono in grado di formare triple eliche
Hanno altissima resistenza alla degradazione in vivo
Si possono sintetizzare con una chimica simile a quella
utilizzata per ottenere proteine artificiali
Duplex PNA:DNA
Prima struttura ottenuta
mediante diffrazione a
raggi-X
Passo dell’elica: 16 bp
DNA è distorto
La conformazione del
PNA è conservata
V. Menchise, G. De Simone, T. Tedeschi, R. Corradini, S. Sforza, R. Marchelli, D. Capasso,
M. Saviano, C. Pedone, submittedV. Menchise, G. De Simone, T. Tedeschi, R. Corradini, S. Sforza, R. Marchelli, D. Capasso,
M. Saviano, C. Pedone, Proc Nat Acad Sci USA, 2003, 100, 12021-12026.
Applicazioni di acidi nucleici
artificiali
DIAGNOSTICA
SONDE A DNA
SONDA AD ACIDO NUCLEICO
Legami a idrogeno
specifici
Watson-Crick
DNA O RNA
da analizzare
Segnale
Innesco di una reazione
“LETTURA” DELLA SEQUENZA
ACIDI NUCLEICI
(OLIGONUCLEOTIDI)
DI SINTESI
CON SEQUENZE DIVERSE
IN POSIZIONI PREFISSATE
DNA O RNA
DA ANALIZZARE
(MARCATO CON
UN GRUPPO CHE
LO RENDE “VISIBILE”)
DNA CHIPS
O MICROARRAYS
DIMENSIONI:
1 CM X 1 CM CIRCA
LEGAME CON LA
SEQUENZA
COMPLEMENTARELA POSIZIONE
INDICA QUALE E’ LA
SEQUENZA
COMPLEMENTARE
Analisi differenziale dell’espressione
genica
mRNA
Cellula sana Cellula malata
DNA Chips (microarrays)
G1 G2 Ev1 Ev2 Ev3 Ev4 Ev5
G1 G2 Ev1 Ev2 Ev3 Ev4 Ev5G1 G2 Ev1 Ev2 Ev3 Ev4 Ev5
Soia 0% OGM
Mais MON810 OGM
Mais, 0% OGM
Soia RR OGM
Mais Bt 11 OGM
Mais Bt 176 OGM
Mais GA21 OGM
ANALISI MULTIPLA DI OGM
Applicazioni di acidi nucleici
artificiali
SVILUPPO DI NUOVI FARMACI
RNA polimerasi
Pre-mRNA
Fattori di trascrizione
mRNA
Proteina
Filamento di
DNA
DNA Trascrizione
Splicing
traduzione
DecoyAnti-gene
Anti-sense
RISC attivazione
Anti-miR
Degradazione di
mRNA
miRNA
= DNA ON
Acidi nucleici come
potenziali farmaci
• Contro RNA o DNA virali (antivirali)
• Contro RNA o DNA batterici (antibiotici)
• Contro RNA o DNA di oncogeni (antitumorali)
• Contro malformazioni genetiche
• PROGETTAZIONE ALTAMENTE RAZIONALE
(BASATA SULLE SEQUENZE BERSAGLIO NOTE)
SI POSSONO COMBATTERE MALATTIE MOLTO DIVERSE CON LO
STESSO TIPO DI FARMACO
Strategia anti-gene in vivo
• Topo di Controllo e topo trattato con PNA
(14 gg). Le frecce indicano il tumore
CONTROLLO TRATTATO
Oltre il farmaco
• Guidare il destino delle cellule
– Differenziamento
– Morte programmata (apoptosi)
• Terapia genica
– Modificare il patrimonio genetico introducendo
geni dall’esterno
• Riparazione genica
– Indurre la correzione di una aberrazione
Nanotecnologie basate su DNA
“There’s plenty of space at the bottom”
Feynman,1960
Approccio top-down: miniaturizzazione delle
lavorazioni
Approccio bottom-up :
autoassemblaggio (self assembly)
delle molecole
DNA Origami
DNA artificiale
DNA naturale
100 nm 100 nm
P.W.K. Rothenmund Nature 2006, 440, 297-302
Scala 1 : 2 1014
100 nm
100 nm
Sapere e saper fare
Rosangela MarchelliStefano SforzaTullia TedeschiAndrea GerminiArnaldo Dossena
Filbert Totsingan
Alessandro Accetta
Alessandro Tonelli
Alessandro Calabretta
Andrea Faccini
Alex Manicardi
E molti altri…
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GRAZIE PER L’ATTENZIONE
