Adriana Maggi

METODOLOGIE DI IMAGING PER LO STUDIO DI EVENTI MOLECOLARI IN ORGANISMI VIVENTI

L’IMAGING FUNZIONALE PERMETTE DI

STUDIARE EVENTI MOLECOLARI IN

CELLULE E ORGANISMI MULTICELLULARI

CON L’APPLICAZIONE DI SISTEMI

REPORTER

SISTEMA REPORTER = MOLECOLE FACILMENTE

VIASUALIZZABILI E MISURABILI CHE

RIPRODUCONO FEDELMENTE L’EVENTO

MOLECOLARE IN STUDIO

Atr i reporter più uilizzati:

Tra i reporter più utilizzati: cloramfenicolo acetiltransferasi, fosfatasi alcalina, beta galattosidasi, beta-glucuronidasi, luciferasi, proteina verde fluorescente

β-glucuronidasi: un enzima presente in vertebrati e molluschi che agendo su substrati incolori quali:5-bromo-4-cloro-3-indolil-glucuronide determina la formazione di un composto di colore blu4-metlbelliferil-beta-D-glucuronide determina la formazione di un composto fluorescente

Cloramfenicolo acetiltransferasi: un enzima di origine batterica in grado di transferire un gruppo acetilico da acetil-COA (radioattivo) al cloramfenicolo

β-galactosidase un enzima idrolitico che agisce sul substrato X-gal trasformandolo in galattosio e 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole che, ossidato a 5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo produce un prodotto insolubile di colore blu

Low sensitivity in the absence of enhancer (this is not an enzymatic reaction)

Monomeric, no substrate required, not expressed in mammalian, variants with different of emission

Green fluorescent protein (GFP, and variants RFP, BFP)

Very high background in selected cell types

Secreted protein, enzymatic assay extremely sensitive.

Fosfatase (human)

Detection needs the cofactor O2, ATP. Substrate quite expensive

High specific activity, very low background)

Luciferase(insect)

Presence of endogenous activity in mammalian cells, tetrameric enzymes- non linear response

Well characterized, stable, low cost substrate, detectable by automtized systems

B-Galattosidase (Bacateria)

DISADVANTAGESADVANTAGESGENE

Reporter bioluminescenti e fluorescenti

Tipiche molecole reporter per imaging sono:

Molecole fluorescenti (GFP, YFP, others),

proteine strutturalmente omologhe contenenti

sequenze di tre aa in grado di funzionare da

cromoforo

Molecole bioluminescenti (fotoproteine e

luciferasi) proteine che diventano/emettono

particelle luminose in prsenza di specifici

cofattori o substrati

Green fluorescent protein (GFP) di medusa (Aequrea victoria)

Una proteina composta da 238 aa la cui struttura spaziale determina la formazione di una struttura a forma di “lattina di birra” al cui interno risiede il cromoforo (un

tripeptide formato da serine 65, tyrosine 66, glycine 67 ).L’emissione è a = 504 nm)

Discosoma red flu

orescent

protein chromophore

The Zoanthus yellow

fluorescent protein

chromophore

Anemonia sulcata "kindling" fluorescent protein

Trachyphyllia geoffroyi "Kaede" red fluorescent protein chromophore

Natural Fluorescent proteins

Synthetic Fluorescent proteins

luciferin + ATP → luciferyl adenylate + Ppi

luciferyl adenylate + O2 → oxyluciferin + AMP + light

La reazione catalizzata dalla luciferasi consiste in due passaggi:

Nel caso della celentrazina, il Ca++ causa un cambiamento conformazionale che destabilizza la perossi-celentrazina con conseguente ciclizzazione, decarbossillazione ed emissione di Co2 e bioluminescenza

I sistemi reporter nello studio della regolazione dell’espressione genica

Con i sistemi reporter è possibile studiare sia gli elementi cis che trans di regolazione della trascrizione.

Inoltre è possibile effettuare lo screening di molecole in grado di interferire con l’espressione del gene reporter.

Questo principio può essere esteso agli animali transgenici

X

Y

Gene reporterPromotore

Elementi di regolazione cis

Z

Elementi di regolazione trans

Proteina facilmente dosabile

Identificazione di molecole attive su fattori di trascrizione.

ER cDNA

ERE LUC Potenziali ligandi

CTR CTRE2

LU

C U

nit

sLUC

ERER

I sistemi reporter nello studio di rilascio/sintesi di trasduttori del segnale

I sistemi reporter nello studio di interazioni tra proteine

GENERAZIONE DI SISTEMI REPORTER Ingegneria Cellulare

Modificazione del genoma di cellule in coltura mediante mutazioni del genoma stesso o mediante l’inserimento

di DNA esogeno

La scelta del sistema cellulare

• coltura primaria

• cellula immortalizzata

• linea tumorale

Transfezioni stabili o transienti

Transfezioni transienti: il gene esogeno entra nel nucleo e viene trascritto dalla RNA pol II ma non si integra nel genoma della cellula transfettata. Viene perduto dopo pochi cicli replicativi

Transfezioni stabili: il gene esogeno viene integrato nel genoma della cellula ed in presenza di una adeguata pressione selettiva viene mantenuto per numerosi passaggi in coltura.

La probabilità di integrazione stabile è dell’ordine di 10-4, 10-6 sul totale delle cellule transfettate

Scelta della tecnica di transfezione

Microiniezione

Adsorbimento mediante DEAE-Destrano

Coprecipitazione con calcio fosfato

Lipofezione

Elettroporazione

Infezione con vettori virali

Imaging dell’espressione genica attraverso i sistemi reporter. Le proteine fluorescenti (GFP e BFP).

Citosol BFP

Golgi GFP