Incontro con i Centri Trasfusionali della Regione MarcheAncona, 27 Maggio 2010
ALTRI PROGRAMMI EQA UKNEQAS DI COMPETENZA DEL LABORATORIO
TRASFUSIONALE:Raggiungere e Mantenere l’Eccellenza
Bruno BrandoDirettoreCentro Trasfusionalee Laboratorio di EmatologiaOspedale di Legnano (MI)[email protected]
Azienda Ospedaliera Ospedale Civile di Legnano
Membro dello Steering Committee
For Leucocyte Immunophenotyping
UKUK NEQAS
I PROGRAMMI EQA UKNEQAS DI COMPETENZA DEL LABORATORIO TRASFUSIONALE
• Blood Transfusion Laboratory Practice• Feto-Maternal Haemorrhage
• CD34+ Stem Cells• Low Level Leucocyte Count in leucoreduced products• Immune Monitoring Programme
• Leukaemia Immunophenotyping / MRD• Molecular Diagnostics• PNH Scheme
• General Haematology• Blood Coagulation
Di StrettaCompetenzaTrasfusionale
Laboratori diEmatologia oTrasfusionali
Ematologia eCoagulazione
Mettiamo un po' d'ordine nella terminologia...
IQCIQC (Controllo Interno di Qualit(Controllo Interno di Qualitàà):):Esercizio autoprodotto o distribuito dalle Ditte del settore, che include materiali a vari livelli direattività attesa (es. Low, Med, High).Assicura la precisione e la riproducibilità dei dati.
VEQVEQ (Valutazione Esterna di Qualit(Valutazione Esterna di Qualitàà):):Esercizio promosso da Società Scientifiche, Regioni,Università, che si limita a descrivere la distribuzionedei dati analitici ottenuti dai partecipanti su campionia titolo ignoto inviati periodicamente.
EQASEQAS (External Quality Assurance Scheme):(External Quality Assurance Scheme):Valuta l'intero processo analitico, favorendo il passaggioa tests di migliori prestazioni. Di natura educazionale, ègestito solo da enti accreditati, che devono intervenire in caso di prestazioni insoddisfacenti. Punta al raggiun-gimento ed al mantenimento di risultati di eccellenza.
UK NEQAS ORGANISATION & ADVISORY STRUCTUREUK NEQAS ORGANISATION & ADVISORY STRUCTURE
HostAuthorities
UK NEQAS
Consultant Executive BoardAdvisor Trustees Joint
WorkingGroup
RegulatoryBody
CPA(UK) Ltd
local accountability(facilitation)
professionalaccountability
externalaccountability
(financial & policy)
co-ordinationand services
professionalaccountability
accreditationto standards
advise and support
UK NEQASSteering
committee
IndividualIndividualUK NEQASUK NEQASschemesschemes
other EQAS
INDIVIDUALLABORATORY
National QualityAssuranceAdvisory
PanelNQAAP
performancesurveillance
performancesurveillance
UKNEQAS QUALITY MANUAL
• Riassume tutte le modalità operative del sistema UKNEQAS e dei suoi
processi di certificazione e accreditamento.
• Revisionato ogni 6 mesi.
• Riporta tutti i criteri utilizzati per la definizione degli scores e dei livelli
prestazionali, richiamabili come riferimento nei propri sistemi qualità.
• Dà un’idea della complessità organizzativa e gestionale attualmente
richiesta ad un promotore di schemi EQA, a garanzia dei partecipanti.
• Può costituire una traccia per impostare un sistema qualità specifico
per i laboratori di citometria.
UK NEQAS for Leucocyte UK NEQAS for Leucocyte ImmunophenotypingImmunophenotyping
Seven Full Schemes:
Participants (5/10)
Immune Monitoring 645Leukaemia Phenotyping & Diagnosis 227+ 449CD34+ Stem Cell Quantitation 279Low-Level Leucocyte Counting 112Molecular Analysis of HaematologicalMalignancies 116+ 102Minimal Residual Disease 37PNH Analysis 99
Worldwide
CD34+
776 VERI CD34+
Flow-Count
CD45+
Cellule NUcleateCellule NUcleateCellule NUcleateCellule NUcleate
Gate su Cellule NucleateNO Beads
Gate su CD45+
Gate su Nucleate CD45+ CD34+
4089 BeadsCD34+ 45+ SSC Low
776 CD34+ eventi
4089 Bead eventix 1012 = 192 CD34+ PBSC/µL(# beads/µL)
Metodo EWGCCA – ISHAGE in Singola Piataformaper l’Identificazione e il Conteggio dei PBSC CD34+
Gate su Nucleate CD45+ CD34+ SSC Low
SSC/FSC SSC/CD45 SSC/LDS751
CD34+
0,012% 0,016% 0,018%
CALCOLO DEL VALORE PERCENTUALEDI CD34+
COEFFICIENTE DIVARIAZIONE (CV)TRA I DIVERSIDENOMINATORI:
30 - 80 % Per Valori di CD34+ Inferiori all' 1%
PROBABILMENTE IL MIGLIOR DENOMINATOREOGGI IDENTIFICABILE: LDS751 AND CD45LDS751 AND CD45
0 256 512 768 1024
Side Scatter ->
0 256 512 768 1024
Side Scatter ->
SOGLIA su LDS751
Consigliabile impostare la SOGLIA su LDS751
CONTEGGIO DEI PBSC CD34+ NELL’ AUTO- e ALLOTRAPIANT OApplicazioni e Pericoli
• Conteggi dei PBSC CD34+ in numerosi punti CRUCIALI del processo:
• Monitoraggio ripresa post-chemio
• Decisione di eseguire l’aferesi
• Calcolo della resa aferetica
• Calcolo del quantitativo raccolto nella sacca di aferesi
• Calcolo delle cellule CD34+ VITALI al momento del congelamento
• Calcolo delle cellule CD34+ VITALI dopo manipolazioni (purging)
• Calcolo delle cellule CD34+ VITALI al momento del TRAPIANTO
• Applicazioni extra-trapianto del conteggio dei CD34+ periferici
IL VERO PERICOLO E’ QUELLO DI SOVRASTIMARE I CONTEGGI DI CD34+
(Raccolgo con troppo poche cellule, Credo di avere raccolto abbastanza, Credo di avere CD34+ vitali a sufficienza...)
Comparative Analysis of Comparative Analysis of InterInter--LaboratoryLaboratoryCVs for CD34CVs for CD34++ Enumeration by PlatformEnumeration by Platform
Sample All Dual Single
A 44.2% 44.2 36.9
B 30.2% 32.6 4
C 26.9% 26.9 22.8
D 29.7% 29.7 23.9
E 38.5% 30.8 21.4
F 18.8% 19.0 4.9
G 31.3% 25 25
H 18.9% 22.3 3.1
I 27.3 27.3 25
Effect of Gating Strategy
0.00
10.00
20.00
30.00
40.00
50.00
60.00
70.00
80.00
90.00
6 9 12 17 20 23 26 29 32 35 38 41 44 47 50 53
Trial6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54 57
0.00 CD34+0.00 CD34+
UKUK NEQAS
Trial CV%ISHAGEBender protocolMilan protocol
VA
LUE
(A
BS
6 C
V%
)
57%32%
1%
1%
2%1%
5%
1% Correct
Missing gate
Gating on wrong parameter
Using wrong antibody
Missing plot and gate
Wrong gate and parameter
Wrong gate and parameter andmissing gate
Using different protocol to thatstated
Inchiesta su COME viene usato il protocollo ISHAGEdai partecipanti allo schema UKNEQAS CD34+
Ex 0706Issued both with CD34 stem cell counts <10 cells/ul
We have relaxed the scoring system to reflect the degree of difficulty in these samples
Ex 0801Please note if you are a UK laboratory our Steering Committee and the Haematology NQAAP require all UK laboratories to use a single platform approach when undertaking CD34 stem cell enumeration.
Effect of Instrument Service on Performance
0
5
10
15
20
25
30
35
40
031 033 035 037 039 041 043 045 047 049 051 053 055 057 059 061 063 065
Trial
Run
ning
Sco
re
OneYear
OneYear
OneYear
Service Performed
Partecipante A B C D E F G H
Esercizio
O702
O703
O704
O705
O706
O801
O802
O803
Non Return
Outlier
CD34 Scheme: Italian UPs & PUPs
Qualcuno sembra non volere fare sforzi per migliorare...
Cellule CD34+ nelSangue PerifericoNORMALE
DONATORI (19-65a)NORMALI (n= 35)
%Mean = 0.063 %ABS Mean = 4.41 /μL± SD ABS = 0.42Mean CV % = 7.7%%min = 0.01%%Max = 0.13%
ABS min = 0.01/μLABS Max = 6/μL
CV dei Replicati= 5 – 15%
R4
R1
R3
R1
R3
R2
300.000eventiacquisiti
0.0130 – 3200 – 1420
2.0 – 10.03.0 – 57.1
4.112.6
<0.00115 (25)29 (59)
Number of Cytopenias0 – 12 - 3
<0.0010 – 762.4 – 1717.4 - 1420
1.0 – 13.64.0 – 25.215.0 - 128
3.710.882.2
<0.00122 (30)11 (52)11 (84)
Bone Marrow Blasts (Microscopy)< 5%
5% - 10%11% - 20%
<0.0010 – 14200.6 – 1711 – 320
1.7 – 11.74.6 – 37.3
16.9 – 57.8
4.037.357.8
<0.00122 (27)19 (20)13 (93)
Karyotype ClassGood Outcome
Intermediate OutcomePoor Outcome
<0.0010 – 30.50 – 86.9
7.4 – 1420
1.2 – 6.41.7 – 14.3
18.2 – 85.4
3.24.158.5
<0.0015 (12)16 (38)23 (92)
IPSS ClassLow Risk
Intermediate Risk-1Intermediate Risk-2 / High Risk
# and % of pts withCD34+ > 10/µL
# (%) p-value Median 25 th-75th perc Range p-value
Circulating CD34+ / µL
Circulating CD34+ Cells in MDS patients stratified by IPSS and its determinants
Cesana C, Klersy C, Brando B et al. Leuk Res 2008; 32: 1715 - 1723
Long-term overall survival of MDS patients according to baseline CD34+ cells / µL
Months
Cum
ulat
ive
Pro
port
ion
Sur
vivi
ng
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0 20 40 60 80 100 120 140
Circulating CD34+ Cells </= 10/µL
Circulating CD34+ Cells > 10/µL
P<.0001
Cesana C, Klersy C, Brando B et al. Leuk Res 2008; 32: 1715 - 1723
PROBLEMI CAUSATI DAL TRASFERIMENTO DIWBC RESIDUI NELLA TRASFUSIONE
• Reazioni Febbrili (Ridotte dalla lavorazione Top&Bo ttom)
• Trasferimento di Microrganismi (CMV, EBV, HSV, Toxo ...)
• Trasferimento di Prioni (Creutzfeld-Jacob Variants)
• Immunizzazione ANTI-HLA (Trapianti d’organo solido )
• Refrattarietà Piastrinica (Pazienti oncologici)
• Reazione GVH Acuta Trasfusionale (pz immunodepressi )
• Immunosoppressione Trasitoria (Immuno-modulazione)
CD4+ T Cells
CD34+ PBSC
WBC Residui
10 - 50%
0.01 - 6.0%
-
50 - 2000 /µL
0.1 - 350 /µL
0.00 - 5 /µL
% / µL
Range Valori
• Diversi range di valori % e /µL• Diverse richieste in termini di precisione
• Diversi setup strumentali
UnUn’’unitunitàà di Emazie prefiltrate deve venire DECLASSATAdi Emazie prefiltrate deve venire DECLASSATAse il conteggio di WBC Residui se il conteggio di WBC Residui èè = > ~ 3 Cells / = > ~ 3 Cells / µµLL
ACCEPTABLE RESIDUAL CELL LEVELSIN PLASMA (Obtained by Fractionation)
EC law 2002 / 98
• Red Cells < 6 x 10 9 / Liter (< 6000/µL)
• White Cells < 0.1 x 10 9 / Liter (< 100/µL)
• Platelets < 50 x 10 9 / Liter (< 50000/µL)
Fresh Frozen Plasma obtained by fractionation cantransfer residual cells which may enhance anti-RBC,anti-PTL and anti-HLA responses.Apheresis Plasma is virtually cell-free.
500 µLSTAININGMEDIUM
100 µLANY
BLOODPRODUCT
100 µLFlow -CountBEADS(Or TruCOUNTTube)
500 µLSTAININGMEDIUM
5 µLANY
NORMALPLASMA
500 µLSTAININGMEDIUM(Plus Beads)
+CTRL
–CTRL
TIPS & TRICKS
* Staining is Almost Immediate* Run NEGATIVE CTRL First* Pass RINSE Solution after
running Positive CTRL or aftera rWBC-Rich sample
* Process ≥≥≥≥ 15 µL raw sample
Medium di Colorazione DNA - WBC Residui
• Sodio Citrato 1g / Litro
• Propidio Ioduro 50 mg / Litro Sigma P 4170
• IGEPAL CA630 200 µL / Litro Sigma I 3021
• RNAsi A III 6 mg / Litro Sigma R 5125
Preparare 100 mL alla volta, filtrare con 0.22 µm M illipore,
Conservare a 4 °°°° C in vetro scuro, stabile ≥≥≥≥ 1 mese.
Marker Events MeanAll 22884 1496.19
rWBC 39 94.50Beads 20845 1499.88
res WBC
rWBC
Beads
BEADS
FLOWCOUNT 1026/µL
Flow-Count
Beads
rWBC = 39 / 20845 * 1026 = 1.91/µL
Flow -Count
Marker Events CVAll 10947 27.37
rWBC 842 10.48Beads 10105 5.83
res WBC
rWBC
Beads
BEADS
WBC Residui negli Emocomponenti Leucodepleti
rWBC = 86.8 /µL(Declassare la sacca!)
Pro
pidi
o Io
duro
Manufacturer Mean rWBC/µL rWBC/Unit x10^6 % Rejected Proces s Time
Baxter 1 0.001 ± 0.003 0.0003 ± 0.0001 0 6.2 min
Baxter 2 3.09 ± 2.86 0.83 ± 0.75 30 11.2 min
Braun 5.97 ± 4.20 1.53 ± 1.17 70 5.2 min
Fresenius 1 1.72 ± 1.55 0.47 ± 0.44 20 7.6 min
Fresenius 2 0.86 ± 0.59 0.23 ± 0.19 0 8.7 min
Pall 2.48 ± 1.58 0.67 ± 0.47 20 5.2 min
Terumo 2.59 ± 2.04 0.67 ± 0.59 20 6.9 min
Studio di comparazione di 7 diversi sistemi di filtrazione in-linea(Gara di aggiudicazione - Sacche quadruple con filtro)
Valutata una campionatura di 10 sacche per ogni concorrente.Parametri valutati: Recupero emazie, Emazie residue nel filtro,Tempo di processamento, rWBC/µL e rWBC/Unità.
Ex # - sample CD4+ ABS CD4+ %
0801-196 280 9,9
0801-197 217 28,3
0802-198 56 2,7
0802-199 100 4,5
0803-200 306 20,1
0803-201 828 53,8
0804-202 804 55,3
0804-203 740 51,7
0805-204 228 19,2
0805-205 186 13,8
Il processamento dei preparati cellulari con Clinimacs Miltenyipermette di generare campioni con valori di CD4 anormali
EX 0802: Nuova modalità di calcolo dello Score
• Scorporando gli scores per CD3, CD4 e CD8 emerge ilcontributo relativo delle varie misure.
UK NEQAS for Leucocyte Immunophenotyping
CV della Conta Percentuale di CD4+ nel TempoUtilizzatori di "Leukogate" CD45/CD14
0
5
10
15
20
25
30
35
40
20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Trial
cv
Tutti i partecipanti Utilizzatori di
Gate CD45 / CD14
Introduzione delGate CD45 / SSC
Effetto dell'introduzione di cambiamentinella pratica di lavoro
Introduzione delleguardie notturne
Ospedale Niguarda 2002-2003
Immune Monitoring Scheme
UK NEQAS and IQA (Duke) have reported the introduction of VERIQAS, a CD4+ T lymphocyte training panel using stabilized whole blood specimens that provides immediate feedback via an interactive website.
Ex # # Outliers
O805 28
O804 24
O803 19
O802 23
O801 24
Immune Monitoring SchemePoor Performers & Persistent Poor Performers
Per la difficoltà di accettare il criterio BCSH di definizione dei positivinelle distribuzioni omogenee di fluorescenza, si tende a riportare valori"polarizzati" attorno a 0% (neg) e 100% (pos). E' un problema!
Questions Raised by Leukaemia Scheme # 0904
• Why the slide is submitted to expertevaluation “in isolation of all otherclinical or laboratory information” ?
• Auer rods were noted by the expertreviewer in the slide, but they were undetectable in the digital images (both at Immunophenotyping and
at Diagnostic Interpretation).
• How to evaluate Myelodysplasia-related leukaemia if the availabledigital images were just peripheralblood with no other maturation lines?
• Is there any Cytometric cutoff valuefor Myeloperoxidase? (i.e: 3%, 5%,20%?....)
DOMANDE E PROBLEMILeukaemia Scheme # 0904
• Perché il revisore esperto valuta il vetrino “isolatamente da altri dati clinici e di laboratorio” ?
• Corpi di Auer sono stati notati dal revisore sul vetrino, ma erano assenti nelle immagini digitali fornite.
• Come diagnosticare una LAM MDS-correlata, se le immagini disponibili sono solo periferico senza altre lineematurative?
• Quale può essere oggi il valore di cutoff Citometrico per la Mieloperos-sidasi? (i.e: 3%, 5%, 20%?....)
Questions Raised by Leukaemia Scheme # 0906
• Case # 0906 was referred to UKNEQASas a MANTLE CELL Lymphoma.
• 53% participants diagnosed Mantle CellLymphoma, according to a phenotypicscore system (Leukemia 1994;8:1640).
• No t(11;14) nor Cyclin D1 status wereavailable. MCL is usually FMC7+ and CD79b+ (case 0906 was negative forboth). sIg intensity level is not easilyevaluable in stabilized samples.
• At the end of the diagnostic workup,Case # 0906 was reclassified by thereferring clinical Centre as a “Heavy disease load of lymphoma, B- chronic lymphocytic leukaemia / smalllymphocytic lymphoma” !
DOMANDE E PROBLEMILeukaemia Scheme # 0906
• Il Caso # 0906 è stato riferito a UKNEQAS come un NHL Mantellare.
• Il 53% dei partecipanti ha diagnosticatoun Linfoma Mantellare, probabilmenteseguendo i criteri di score fenotipico indicati in Leukemia 1994;8:1640.
• Non erano riportati dati su t(11;14) nésu Ciclina D1. MCL è di solito FMC7+ e
CD79b+, ma il caso 0906 era negativo.L’intensità delle sIg non è ben valutabilenei campioni stabilizzati.
• Sulla base di una BOM il centro clinicoha quindi riclassificato il caso 0906 come: “Infiltrato linfomatoso di alto grado da LLC-B / Linfoma Linfocitico a Piccole Cellule” !
SOMMARIO Esercizi 0705 - 1002
• Ingresso della Dssa Wendy Herber (Cambridge) nello steering committee ha migliorato l’analisi morfologica dei casi.
• L’elenco di ‘Core Antigens’ e di ‘Optional Antigens’ indica la traccia cheun ematologo esperto potrebbe dare al suo laboratorio di citometria perottimizzare il pannello di marcature (economia!).
• Emerge in alcuni casi un forte effetto ‘Clone’ o ‘Fluorocromo’, conimpatto sulla qualità dei risultati.
• Si rileva una notevole ‘sensibilità’ da parte di partecipanti (italiani e non)sugli scores generati anticorpo per anticorpo: fino a 100 per ciascun anticorpo non c’è da allarmarsi . Scores sistematicamente alti per singoli anticorpi possono indicare scarsa sensibilità o poca specificità dei coniugati impiegati.
PNH SchemePNH Scheme
Developing biological control material for internal & external quality assurance.
withDr S. Richards, HMDS, Leeds
23%
10%
66%
25%
11%
64%
Day 1 Day 113
Stabilised PNH Granulocytes
PNH Pilot StudyPNH Pilot Study
• Issued to 90 sites. 58 returned results.• Small minority of participants could not detect a PNH
clone.• Two participants detected a PNH clone with the
normal sample issued.• CD 59 was used by 83% of participants for the
detection of the red cell clones.• CD 55 and 59 was used by 80% of participants for
the detection of the granulocyte clones.