“SperimentailBioLab”

Iden4ficazionedegliOGM

UniversitàdegliStudidiMilanoSe3oreDida5co,viaCeloria20,Milano

Laboratorio105

Indice

1.Conoscenzepropedeu4che p.3• 1.1CosaèilDNA p.3• 1.2Lastru3uradelDNA p.4• 1.3DalDNAalcromosoma p.4• 1.4GenoHpoefenoHpo p.5• 1.5ReplicazionedelDNA p.5• 1.6Ve3oridiclonaggio p.5• 1.7Trasformazione p.6

2.IntroduzioneagliOGM p.6• 2.1ComesifannogliOGM p.6• 2.2PerchésifannogliOGM? p.7• 2.3Fasidell’analisidiunOGM p.8

3.Primadiandareinlaboratorio p.9 .3.1Preparazionedelcampione p.9

4.Tecnicheu4lizzatenell’aHvitàdilaboratorio p.11

5.Iden4ficazionediunOGM p.14 • 5.1Resistenzaagliinse5 p.14• 5.2Tolleranzaaglierbicidi p.15• 5.3Ilcostru3ousatopertrasformarelapiantep.16• 5.4Protocollosperimentale p.17

5.4.1Ele3roforesisugeldiagarosio;soluzioniereagenH p.17 5.4.2Preparazionedelgeldiagarosio p.175.4.3Corsaele3roforeHca p.185.4.4Interpretazionedelrisultatodellacorsaele3roforeHca p.19

6.Normegeneralidisicurezzainlaboratorio p.20

7.Quizdiautovalutazione p.22 8.Glossario p.30

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1.Conoscenzepropedeu4che

1.1Cos’èilDNA?

DNAstaperDeoxyriboNucleicAcid;èunacomplessasostanzachimicachesitrovanelnucleoditu3elecelluleeportal’informazioneperlosviluppodegliorganismi.

• Il DNAè ilmateriale ereditario responsabile delle cara3erisHchedegli individui e quindidellesomiglianzeedifferenzetraglistessi.

• IlDNAèunico,diversodaindividuoaindividuo,ecce3ocheperigemellimonozigo4ci, ilcuiDNAèidenHco.

• IlDNAèvisualizzatoso3oformadicromosomiduranteladivisionecellulare.

1.2LastruUuradelDNA

La molecola del DNA è un polimero, ossia è un insieme di tanH monomeri: i nucleoHdi. OgninucleoHde è cosHtuito da tre componenH:un g ruppo fos fato, uno zucchero(desossiribosio) e una base azotata. Lamolecola di DNA è formata da due catenepolinucleo4diche avvolte l’una intornoall’altra con andamento destrorso. Le duecatenesonoan4parallele,cioèiduesingolifilamenH sonoorientaHuno indirezione5’→3’el’altro3’→5’.Glischeletrizucchero– fosfato si trovano all’esterno, le basiazotateall’interno.Lebasidelleduecatenesono unite tra loro mediante legami aidrogeno (F ig. 1) . Le basi sonocomplementarieilloroappaiamentoè:A=TAdenina-TiminaG≡CGuanina-CitosinaL’informazione geneHca risiede nellasequenzadibasi.

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Fig. 1. Struttura della doppia elica del DNA.

1.3DalDNAalcromosoma

Ciascun cromosoma eucarioHco conHene una lunga doppia elica di DNA che si estende da unaestremitàall’altradelcromosomastesso.LalunghezzacomplesssivadelDNAdei46cromosomidiuna cellula umana, è circa 2metri; ne deriva quindi la necessità di compa3are (spiralizzare) lamolecola,perchèlasualunghezzasiacompaHbileconledimensionidelnucleo.Alla molecola di DNA sono associaH gli istoni (proteine basiche), essenziali per perme3erel’avvolgimento e il ripiegamento del DNA in stru3ure estremamente compa3e, vale a dire icromosomi,visibilisoloduranteladivisionecellulare.IlprocessodispiralizzazionedelDNA(Fig.2)prevedelivellisuccessividiavvolgimento(compa3amento).

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Fig. 2. I livelli di organizzazione della cromatina che danno origine ad un cromosoma euariotico.a) Doppia elica di DNA

b) “Collana di perle” di nucleosomi

c) Fibre di nucleosomi addensati a forma di solenoide

d) Domini ad anse

e) Spirali condensate

f) Cromosoma metafasico

a)

b)

c)

d)

e)

f)

1.4Geno4poefeno4po

Ilgeno4poè la cosHtuzionegeneHcadiuna singola cellulaodiun singoloorganismo,mentre ilfeno4poèl’insiemedellecara3erisHchevisibilioinqualchemodoevidenziabilidiunacellulaodiunorganismo.Adesempio,fenoHpoènonsoloilcoloredegliocchi,ilcoloredellapelleol’altezza(cara3erisHche visibili), ma anche il Hpo di gruppo sanguigno (cara3erisHca non visibile, maevidenziabileconsaggidi laboratorio),cosìpureunamodificazionegeneHcainunapiantanonsivedeosservandola,mapuòessereevidenziataconlaPCResuccessivaele3roforesi(vedi§2.3).IlfenoHpo non è determinato solo dai geni, ma dipende anche dall’interazione del genoHpo conl’ambiente. La statura di una persona, ad esempio, è influenzata dai geni, tu3avia la loroespressione può essere modificata dalle interazioni con l’ambiente esterno (ad esempio,alimentazione)ointerno(adesempio,ormoni).

1.5ReplicazionedelDNA

LareplicazionedelDNA intu3e lecellulevivenH,daiba3eriall’uomo,èunprocessocomplesso,che richiede l’intervento di più di una dozzina di enzimi diversi. La replicazione comincia in

corrispondenza di siH de5 origine di replicazionepresenH ad intervalli lungo i cromosomi. In quesHsiH, alcune proteine srotolano la doppia elica diDNA, rompendo i legami a idrogeno tra lebasi deifilamenHcomplementari.

L’allineamento e unione tra loro dei nucleoHdicomplementari avviene per azione della DNApolimerasi cheprocede solo in direzione5’→3’. LaDNA polimerasi per iniziare il processo ha anchebisogno di un innesco (de3o anche primer), a cuia3accarsi e procedere con la polimerizzazione.Durante la replicazione del DNA, il primer ècosHtuitodaunacortasequenzapolinucleoHdicadiRNA. La replicazioneè semiconservaHva:ogni emi-elica(singolofilamento)dellamolecolamadreservedastampoperlasintesidiunnuovofilamento,percui ogni doppia elica figlia sarà cosHtuita da unfilamento vecchio e da un filamento nuovo. Lemolecole risultanH sono copie esa3e dell’originale.Da una doppia elica madre derivano due doppieeliche figlie uguali tra loro e uguali alla molecola

madre(Fig.3).

1.6VeUoridiclonaggio

Un ve3ore è una molecola di DNA capace di replicarsi in una cellula ospite. I ve3ori piùfrequentementeusaH inbiotecnologiasono iplasmididelba3erioEscherichia.coli. Iplasmidisono piccole molecole di DNA circolare a doppio filamento extracromosomici che esistononaturalmenteneiba3eri,concuiconvivonocomesimbionH.Sireplicanoautonomamentenellacellulaospite,grazieallapresenzadiunasequenzadiorigine(ORI)dellareplicazione(Fig.4).

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Fig. 3. Rappresentazione grafica della replicazione del DNA, con la formazione dei due nuovi filamenti complementari ai filamenti “stampo” della molecola originaria.

MolH plasmidi contengono geni cheforniscono benefici alla cellula ospite (peresempio geni che codificano enzimi chei na5vano g l i anHb ioHc i , e qu ind iconferiscono resistenza ad essi), o geni ditrasferimento,checodificanoproteinecapacidi formare un tubo macromolecolarea3raverso cui il DNA plasmidico può esseretrasferito ad altre cellule. E’ il caso delp lasmide T i contenuto nel ba3erioAgrobacteriumtumefaciens.Per il clonaggio del DNA si usano plasmidimodificaH geneHcamente in laboratorio, dacui sono staH eliminaH praHcamente tu5 igeni e che contenegono solamente unaorigine di replicazione del DNA (ORI), ungenecheconsentelaselezione(ingenereungene per la resistenza a un anHbioHco, adesempioilgeneampr;checonferisceresistenzaall’anHbioHcoampicillina)eunaregioneincuipossonoessereinseriHisegmenHdiDNAesogeno.

1.7Trasformazione

Latrasformazioneèun’alterazionegeneHcadiunacellula,ba3ericaoeucarioHca,causatadallaassunzione e dalla espressione di DNA esogeno. Incubando ve3ori plasmidici geneHcamentemodificaH con cellule ba3eriche, quest’ulHmepossono acquisire il DNAplasmidico ed esseretrasformate. Per produrre piante geneHcamente modificate (PGM), il plasmide Tiopportunamentemodificatovienereintrodo3onelba3erioAgrobacteriumtumefaciensconcuisuccessivamente si infe3ano le cellule vegetali che si vogliono trasformare. Perché latrasformazionesiastabile(ecioèereditabile)ènecessariocheilDNAplasmidicodiTisiintegrinelcromosomadellacellulavegetale.

2.IntroduzioneagliOGM

2.1ComesifannogliOGM?

GliOrganismiGeneHcamenteModificaH (OGM)sonovirus,ba3eri, funghi,pianteeanimali lecuicara3erisHchegeneHchesonostatemodificate in laboratoriomediante l’inserimentodiungene estraneo, de3o transgene. In genere uno o più geni presi da altri organismi vengonointrodo5nelpatrimonioereditariodell’organismochesivuolemodificarea3raversoparHcolarive3ori, tra i quali i più usaH sono plasmidi e virus. In parHcolare, per o3enere piantegeneHcamente modificate (PGM) si uHlizza un ve3ore naturale, il plasmide Ti, presente nelba3erioAgrobacteriumtumefaciens,comeillustratonellafigura(Fig.5).Nel plasmide Ti viene introdo3o, con tecniche di ingegneria geneHca, il gene che si vuoletrasferireallapianta,insiemeadungenecheconsentadiselezionarelecelluletrasformate(peresempioungenecheconferisceresistenzaaunanHbioHco).Si infe3anolecellulevegetaliconl’Agrobacteriumtumefaciens“ingegnerizzato”esiselezionanolecelluletrasformate(resistenHall’anHbioHco).

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Fig 4. Struttura di un plasmide: OR = origine di replicazione del DNA ampr = gene per la resistenza all’antibiotico ampicillina

Adifferenzadellecelluleanimalidifferenziate, lecellulevegetali sonospesso toHpotenHedèpossibile rigenerare una intera pianta da una singola cellula vegetale. Cellule vegetalitransgeniche,quindi,possonodareorigineapiantetransgeniche.

2.2PerchésifannogliOGM?LepiantevengonomodificatepermigliorarnelaqualitàdamolHpunHdivista:

• a5vitàinse5cida,• resistenzaaerbicidi,• tolleranzaastressambientali,• vitapiùlungaomaturazioneritardata,• migliori qualità nutrizionali delle proteine del

seme,• allungamentodeitempidiconservazione,• nuovastrategiaperlaproduzionedivaccini.

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Fig.5. La produzione di piante transgeniche resistenti alla larva della piralide è realizzata mediante tecniche di ingegneria genetica su Agrobacterium usato come organismo vettore del gene Bt.

2.3Fasidell'analisidiunOGM

PeresserecerHcheunorganismosiageneHcamentemodificato,bisognaricercarenelsuoDNAlapresenzadiungeneestraneo(transgene)cherende l'organismoospite ingradodiesprimereunnuovo cara3ere,nonHpicodella speciedi appartenenza.GliOGMsono spesso fenoHpicamenteidenHcialHpotradizionaleequivalente,nelsensoche l’aspe3ogeneralenonèdiverso,anchesel’OGMhaacquisitounacara3erisHcaereditarianuova,dovutaaltransgene.LedifferenzepossonoesseretrovatealivellogenoHpico,ecioènellasequenzadelDNA.DunqueperidenHficareunOGMbisognaparHredalsuoDNA.E'possibilecomunqueancheunaviaalternaHvaper idenHficareunOGM. Infa5,poichéungene si esprimea3raverso la sintesidiunaproteina,èanchepossibileeffe3uare la ricerca del prodo3o derivante dall'espressione del gene inserito, ossia la proteinastessa, valutarne le funzioni, ivi compresi i prodo5 che possono derivare dalla sua a5vità (peresempio,produzionedinuovicomponenHnell'organismomodificato).InentrambiiHpidianalisisipartedalprodo3oalimentareinquesHone,de3omatrice.

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…. Quindi o si ricerca il gene o il prodotto del gene……

LanostraanalisisibasasulprimometodoecomprendeleseguenHfasi:

•campionamento•estrazionedelDNA•amplificazioneconPCR•ele3roforesi•analisideirisultaH

3.Primadiandareinlaboratorio

3.1Campionamento

Il campionamento rappresenta una fase criHca in un processo di analisi. La buona riuscitadell'analisidipendeinfa5dallemodalitàconcuiessoècondo3o. Il campionepredispostoall'analisideveperciò essere il più possibile rappresentaHvo dellamatricedipartenzaedessereomogeneo.Lagrandesfida durante la preparazione dei campioni è laproduzione di estra5 di DNA che s ianorappresentaHvi dell'ogge3o in analisi, che moltospesso è dell'ordine di grandezza del carico di unba3ello cargo con migliaia di tonnellate di fave disoia o di mais. A causa del miscuglio durante laraccolta, lo stoccaggio e il trasporto, un prodo3oOGM potrebbe non essere ben distribuito nellamatrice di partenza, essere, per esempio, piùconcentratoinunpuntopiu3ostocheinaltri;perciòquando campioniamo dobbiamo eseguire piùprelievidallamatriceeinpunHdiversi.Se i prodo5 da analizzare sono aliquoteconfezionate, si eseguono prelievi casuali di alcunealiquote,rispe3andolanormaHvavigente.Lapreparazionedelcampionedeveessereeseguitaconmoltecautele,adesempioinambienHdedicaH,inmododaevitareognipossibilecontaminazionedapartediDNAestraneo.I campioni che vengono so3oposH all’analisi perl’idenHficazione della presenza di OGM sonorappresentaH da semi (mais, soia), ma anchesfarinaH e prodo5 alimentari complessi comeprodo5 da forno, prodo5 a base di cioccolato, di

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soia,cornflakesecc. Un organismo gene4camente modificato (OGM) è un organismo vivente che possiedeunpatrimoniogeneHcomodificatotramitetecnichediingegneriageneHca,checonsentonol'aggiunta,l'eliminazioneolamodificadielemenHgeneHci.Con il termine Organismo GeneHcamente Modificato (OGM) si intendono soltanto gliorganismi in cui parte del genoma sia stato modificato tramite le moderne tecniche diingegneria geneHca. Non sono consideraH "organismi geneHcamente modificaH" tu5quegliorganismiilcuipatrimoniogeneHcovienemodificatoaseguitodiprocessispontanei(modificazionietrasferimenHdimaterialegeneHcoavvengonoinfa5innaturainmolteplicioccasioni e tali processi sono all'origine della diversità della vita sulla terra), o indo5dall'uomo tramite altre tecniche che non sono incluse nella definizione data dallanormaHvadiriferimento(incrociemutagenesiindo3aconradiazioniionizzanHomutagenichimici).Gli OGM vengono spesso indicaH come organismi transgenici: i due termini non sonosinonimiinquantoilterminetransgenesisiriferisceall'inserimento,nelgenomadiundatoorganismo,digeniprovenienHdaunorganismodispeciediversa.SonoinvecedefiniHOGManchequegliorganismicherisultanodamodificazionichenonprevedonol'inserimentodialcungene(es.sonoOGManchegliorganismidalcuigenomasonostaHtolHdeigeni),cosìcome gli organismi in cui il materiale geneHco inserito proviene da un organismo"donatore"dellastessaspecie(cisgenici).In Europa l'uHlizzo di OGM è so3oposto a regole molto rigorose e procedure diautorizzazionecomplesseper la lorocolHvazioneecommercializzazione.Daaprile2015, ipaesipossonodecidereseconsenHrelacolHvazionediOGMsulloroterritorio.Tu3avia,perquanto riguarda la commercializzazione, il Parlamento europeoha votato contro i divieHnazionali. All'interno dell'Unione europea, ad oggi, sono solo 2 gli OGM che hanno o3enutol'approvazioneperlacolHvazioneinEuropa:

1. Mais Transgenico della Monsanto 810, approvato nel 1998 (colHvato in Spagna,Portogallo,Slovacchia,RepubblicaCeca,RomaniaePolonia).

2.PatataAmflora,dellaBASF,approvatonelmarzodel2010(colHvatainGermaniaeSvezia)maa3ualmentelaproduzionenonèpiùautorizzata.

Il mais MON810 è una varietà di mais modificata affinché produca una tossina Bt chefunzionadapesHcidaperproteggerelapiantacontroleinfestazionidipiralide(unparassitafitofago del mais). La patata Amflora è il tubero transgenico distribuito e venduto inEuropadallamulHnazionaleBASFnonperscopialimentarimaperl’industriacarHeradatoilsuoaltocontenutodiamilopecHnanell’amido.

Perquantoriguardal'importazionedapaesiterzi,esistono58OGMa3ualmenteautorizzaHnell'Unione europea per il consumo di alimenH emangimi. Comprendonomais, cotone,soia,colza,barbabietoladazucchero. Altrisonoina3esadiautorizzazione(vedilink).

(h3p://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm)

LamaggiorpartedegliOGMautorizzaHnell'UE sonodesHnaHaimangimiper gli animalid'allevamentomaalcunialimenHimportaHpossonocontenernealtri. IlsistemadieHche3aturaalimentaredell'UEimponealleaziendediindicareseglialimenHoimangimicheproduconocontengonoOGM(quandolapresenzaèaldisopradi0,9%delprodo3o.

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InItalia,nonviècolHvazionecommercialediOGM.Sonopermessicampisperimentali,masoloconappositaautorizzazione.

MetodidiindagineperlaricercadiOGM• Analisi delle proteinemodificate mediante tecniche basate su saggi immunologici perriconoscimentoanHgene–anHcorpo:ELISAoWesternBlot•AnalisidelDNAmodificato:mediantePolymeraseChainReacHon(PCR)perilrilevamentoqualitaHvoequanHtaHvo

MetodologieanaliHcheperilrilevamentodiOGMAnalisidelleproteineAnalisidelDNA

TipoELISAPCReRealTimePCR(°)

• Facileesecuzione,conpossibilitàdiautomazione• Elevatasensibilitàespecificità• Rapidi,effe3uabilianchesucampoTESTSTRIP• ApplicabileadalimenHfiniH• Pococostosi,disponibilikitcommerciali• QuanHtaHvi• QuanHtaHvi• Costosi• Sensibilitànonelevata• Richiedonostru3uredilaboratorioadeguate• Sononecessarieproteinenondenaturate

AiseguenHsiHsipuòtrovarel’elencocompletodegliOGMautorizzaHdallaUnioneEuropeaconicara3eriinseriHeirelaHviscopietu3elerispe5vemetodologieanaliHche

h3p://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm

h3p://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp

4.Tecnicheu4lizzatenell’aHvitàdilaboratorio

EstrazionedelDNA

Per estrarre il DNA dai nuclei delle cellule vegetali si devono prima rompere (lisare) le pareHcellulari(ricordarechelecellulevegetali,adifferenzadellecelluleanimali,possiedonounaparete),lemembraneplasmaHchee lemembranenucleari; ciò vieneeffe3uatoponendo il campione inuna soluzione omogeneizzante - lisante contenente un detergente che facilita la ro3ura dellemembrane cellulari e nucleari al fine di liberare il DNAnella frazione solubile ed uHlizzando unomogeneizzatore.In taluni casi, per esempio se il campione è rappresentatoda semi secchi, è richiesta un'azionemeccanicapreliminarecomelatriturazioneperridurrelamatricedipartenzainpiccoleparH.PoichéilDNAèassociatoalleproteineistoniche(vedipar.1.3),l'aggiuntadisalecomeilclorurodisodio (NaCl) alla soluzione, facilita la separazionedelDNAdalleproteine.Dopo centrifugazione,nel supernatante saranno presenH DNA, RNA, proteine, polisaccaridi e lipidi. L'aggiunta diproteinasi e di ribonucleasi facilita la digesHone delle proteine (istoniche e non istoniche) edell'RNA.

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BisognaoraeseguirelaprecipitazionedelDNAdallasoluzione:essaavvienepermezzodell'etanologhiacciato. Il DNA è insolubile in etanolo ghiacciato, perciò aggiungendolo alla soluzione il DNAprecipitaso3oformadifilamenHgelaHnosibianchi.LasoluzioneverràpoicentrifugataeilprecipitatodiDNA, risospesoinacquadisHllatasterileoinunaopportunasoluzionetampone,saràprontoperlesuccessivedeterminazioni.

PCR(PolymeraseChainReac4on)

Si tra3a di una tecnica innovaHva che consiste nell’amplificazione specifica di segmenH di DNAmediantereazioniacatenadellaDNApolimerasi(Fig.6).Ilprincipioèmoltosemplice.DataunasequenzadiDNAadoppiofilamentoeduecortesequenzeoligonucleoHdiche (primer),di cuiunacomplementareadun tra3odifilamentoaunaestremitàdelDNAdaamplificare(forwardprimer)el’altracomplementareadunaltrotra3opostoall’altraestremità (reverse primer), inpresenza di una DNA polimerasitermostabile e di una miscela didesossinucleoHdi trifosfaH inappropriatecondizionidi reazione,è possibile copiare numerosissimevolte il tra3o compreso tra i dueprimers, semplicemente facendovariareciclicamentelatemperaturadireazione.Infa5, raggiunta la temperaturadidenaturazione (circa 95°C), ladoppia elica si apre (fase did e n a t u ra z i o n e ) , r e n d endodisponibile lo stampo per unaeventuale sintesi delle catenecomplementari.Quando la temperatura si abbassa, in virtù delle lorominori dimensioni e dellaloro concentrazione, i primer si legheranno (fase di appaiamento o annealing) al DNA stampoprimachesirinaturie,inpresenzadiunaDNApolimerasiconunopHmumditemperaturaelevato(circa72°C), inizierà la sintesi diDNAaparHredai primer (fasedi sintesidelDNA oextension),procedendolungoifilamenHsingoli.Al terminedelprimociclodiPCRdaunadoppiaelicadiDNAseneo3engonodue.Ripetendo ilciclo"denaturazione–annealing–extension"numerosevolte(ingenereda20a30),sio5eneunamassiccia amplificazione specifica di un dato tra3o di DNA che può quindi essere analizzato estudiatoinde3aglio.IlmetododianalisidelDNAmediantePCRpresentavantaggimoltoevidenH:♦èmoltorapido(da60a90minuH),

♦lamanualitàèsemplicissima,

♦èautomaHzzato,

♦irisultaHsonovisualizzabiliconfacilitàmedianteele3roforesidelDNA

ImportanHambiHdiuHlizzodellaPCRsonoladiagnosiprenataledimala5egeneHcheeleindaginidimedicinalegale(siacivilechepenale).TermociclatoriIlsuccessodellaPCRèdovutoingranparteallapossibilitàdifaravvenirel’interoprocessoinmodoautomaHco all’interno di strumenH de5 termociclatori (thermal cyclers), in grado di variareciclicamente la temperatura tra le varie fasidiogni ciclodiPCR. Il costodiun thermal cycler siaggirasui10.000euro.

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Fig. 6. Schema del processo di amplificazione di un frammento di DNA tramite PCR.

Unesempiodiprofilodiamplificazionestandardimpostatomedianteuntermociclatore(Fig.7)èilseguente:

1. denaturazionedelDNA:30seca94°C2. appaiamento(annealing)deiprimers:30seca50°-60°C 30-35cicli3. sintesi(extension)diDNA:30sec-5minuHa72°C

Taqpolimerasi

Il successo della PCR è stato possibile grazie anche all’uso di una DNA polimerasi termostabileestra3adabaUeri termofili (che vivono ad elevate temperature).UnaDNApolimerasi uHlizzatanellereazionidellaPCRèlaTaqpolimerasi,estra3adalba3erioThermusaqua>cus.L’isolamentodiDNApolimerasitermostabilihasollevatoglioperatoridall’ingratocompitodiaggiungereenzimafrescoadogniciclodireazione!

SceltadeiprimerPerogniPCR,ènecessariousaredueprimer(forwardereverse)La scelta della coppia di primer è criHca per una buona riuscita della PCR, ovvero per o3enerel’amplificazionediuntra3odiDNAinmodospecifico.I primer devono essere “disegnaH” a livello di sequenze uniche nel genoma (presenH una solavolta),inmodochepossanoappaiarsialDNAsolonellazonadiinteresseenoninaltrezone.

EleUroforesisugeldiagarosio

E’ una tecnica che consente di separare in base alle lorodimensioni (peso molecolare) molecole dotate di carica,facendolemigraresuungel inpresenzadiuncampoele3rico. Ilgel può essere immaginato come una rete tridimensionalea3raverso lecuimagliemigrano lemolecoleso3o l’azionediuncampoele3rico.Ilcampoele3ricoègeneratodaunapparecchio,de3oalimentatore(Fig8).Per separare molecole di DNA si usano gel di agarosio. LemolecolediDNAsonocarichenegaHvamenteper lapresenzadigruppifosfatoemigranodalpolonegaHvoversoilpoloposiHvo.Peruncertointervallodipesimolecolari,lavelocitàdimigrazioneèfunzione del loro peso molecolare: tanto più grande è la molecola di DNA, tanto minore è lavelocitàdimigrazione, tantopiùpiccola è lamolecoladiDNA, tantopiù velocementemigra. Le

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Fig.7Termociclatore

Fig. 8. Cella elettroforetica e alimentatore.

molecolediDNAdidiversa lunghezzavengonopertanto separate inbasealladiversavelocitàdimigrazione.Per poter determinare la lunghezza delle molecole di DNA in esame separate medianteele3roforesi,viene“caricato”sulgelancheilcosidde3omarcatoredipesomolecolare,ossiaunamiscela di frammenH di DNA di cui è noto il peso molecolare. Confrontando la posizione deiframmenH a peso molecolare noto con quella dei frammenH di DNA in esame, è possibilecalcolarneilpesomolecolare,ossialalunghezza.Dato che il peso molecolare di un frammento di DNA è proporzionale al numero di coppie dinucleoHdi(basi)chelocosHtuiscono,disolitoessovieneespressoinpaiadibasi(bp).La separazione ele3roforeHca dura circa 1 ora. Al termine, i vari frammenH di DNA, essendoincolori,possonoesserevisualizzaH,immergendoilgelinuncolorante.IlDNAdellediverseclassidipesomolecolareèvisibileso3oformadibandedisHnte:sonolecosidde3ebandediDNA.Perpotervisualizzare ilDNA,durante lapreparazionedelgel,all’agarosiosiaggiunge l’EuroSafe,unasostanzachehalaproprietàdilegarsialDNAedieme3erefluorescenzaseespostaaluceUV.Allafinedellacorsa,lebandesivisualizzanoesponendoilgelallaluceultraviole3a(Fig.9).

5.Iden4ficazionediunOGM

Impostazionedelproblema

Ilmais (Zeamais,de3oanchegranoturco)OGMcolHvato,èstatotrasformatoperfaresìchesiaresistenteagliinse5nocivi,tolleranteaglierbicidi,oconentrambelemodificazioni.

5.1ResistenzaagliinseHLaresistenzaèo3enutafacendoprodurreallapiantaunaproteinatossicapergli inse5prodo3adal Bacillus thuringiensis, un ba3erio del terreno uHlizzato anche in agricoltura biologica comeinse5cidanaturale.Questomicrorganismopossiedeungene(Bt)checodificaperlaproteinaCry,cheèingradodilegarsisele5vamenteaspecificirece3orilocalizzaHnell'epiteliointesHnaledellelarve di alcune specie d’inse5. Il legame della proteina con i rece3ori provoca la distruzionedell'epiteliointesHnaleediconseguenzalamortediquesHinse5.EsistonodiversiHpidiproteineCryprodo3edadifferenHso3ospeciediBacillusthuringiensischeesibisconoun’elevata specificitàdi azionenei confronHdi diversiHpi d’inse5. Imammiferi, nonavendoirece3oriperleproteineCry,sonoresistenHallasuaazionetossica.Perconferireadunaspecievegetaleilcara3erediresistenzaneiconfronHdiunparHcolareHpodiinse3oèsufficienteintrodurrenelsuogenomailgenechecodificaperlatossinaCryspecificaperquell'inse3o. In talmodo la pianta sarà in grado di produrre la proteina Cry che esplica la suaazionebioinse5cidaquandol'inse3odannosoa3accalapianta,cibandosideisuoitessuH.

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Fig. 9. Osservazione del gel alla luce ultravioletta.

IlmaisBtsembrapresentarevantaggiancheriguardoaunaltroproblemadegliagronomi.Nelmaissono spesso presenH tossine (aflatossine) dovute all’infezione da parte di muffe. Le aflatossinehannotossicitàacutaecronicaea5vitàcancerogenasuanimalieuomo.Adesempio,lapiralideèuninse3olecuilarvescavanogallerienellostoccoenellaspigadelmaistrasportandosporefungine,chegeneranoleinfezionisopracitate.UHlizzare mais geneHcamente modificato resistente alla piralide potrebbe risolvere questoproblema.

5.2Tolleranzaaglierbicidi

Diversi sono gli erbicidi uHlizzaH in natura per comba3ere le erbe infestanH. Il glifosato è ilprincipioa5vopresenteinalcunidiessi.

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Fig.10.ComelaproteinaCryagiscenellelarvedellapiralide

Incondizioninormali,organismivegetali,ba3eriefunghiproduconounenzimanotocomeEPSPS(5-enolpiruvil-shikimate-3-fosfato-sintetasi)cheagiscenellabiosintesidegliamminoacidiaromaHcicomefenilalanina,Hrosinaetriptofano.Questoenzimaèprodo3onei ba3eri enellepiante,mentreè assentenegli animali. Il glifosatoagiscedainibitorecompeHHvodell'enzimaEPSPS.Avendounageometriamolecolaresimilealsuosubstrato (il fosfoenolpiruvato), il glifosato compete col substrato naturale per il legame al sitoa5vodell’enzima.

La tolleranza al glifosato èo3enuta inserendo nellapianta un transgene checodifica per una variantedell’enzimacheèpocoinibitadal glifosato stesso. Questavariante di EPSPS è o3enutad a u n c e p p o d i A .

tumefaciens resistente alglifosato.

La pianta geneHcamentemod i fi c a t a s o p rav v i v eall’erbicida poiché l’a5vitàdell’enzima EPSPS di A.tumefaciens è sufficiente arimpiazzarequelladell’EPSPSendogeno, che è inibitod a l l ’e r b i c i d a . L e e r b einfestanH, che non sonotrasformate, muoiono ac a u s a d e l l ’ a z i o n edell’erbicida.Ciò comporta un doppiovantaggio:sialapossibilitàdi

uHlizzare tra3amenH che discriminano tra piante uHli (geneHcamente modificate) ed erbeinfestanH, sia una riduzione dell’uso di erbicidi con conseguente riduzione dei cosH e d’impa3oambientale.

5.3IlcostruUousatopertrasformarelapiante

Il transgene è stato inserito nel ve3ore di clonaggio (vedi paragrafo 1.6) in una casse3a diespressionegenica.Amontedelgenesitrovailpromotorecheregolail livellodiespressionedelgeneeavalleunterminatore,chefungedasegnaledistopper l’RNApolimerasiedetermina lafinedellatrascrizione(Figura13).IgenipiùcomunementeinseriHnellacasse3adiespressionediunapiantaOGMsono:- PromotoreCAMV35S:promotoredelgeneperl’RNA35Sdelvirusamosaicodelcavolfiore,che

ècosHtuHvoedeterminaelevaHlivellidiespressionedelgenechelosegue.- GeneEPSPS:diAgrobacteriumtumefaciensCP4,codificaperla5-enolpiruvilshikimato3-

fosfatosintasi,rendelapiantatolleranteall’erbicidaglifosato.- GeneCTP2-epsps:geneEPSPSacuièstatoaggiuntoilpepHdesegnaledelgeneEPSPSdi

Arabidopsisthalianausatoperveicolarloalcloroplasto(CTP:Chloroplast-TranspepHde-signalsequence).

! 16

EPSPS*

EPSPS

natural substrate: phosphoenolpyruvate

herbicide: glyphosate

WT plant

EPSPS

PEP

EPSPS

glyph

glyph

PEP

glyph

glyph

glyph

glyph

glyph

glyph

glyph

EPSPS*

PEP

EPSPS*

PEP

EPSPS*

PEP

EPSPS

glyph

EPSPS

glyph

GMO plant

EPSPS*: transgene from A. tumefaciensEPSPS*

EPSPS*

PEP

EPSPS

glyph

glyph

glyph

glyph EPSPS

glyph

glyph

glyph

glyph

glyph

glyph

PEPPEP

EPSPS

glyph

Fig.12.Nellepiantewildtype(WT),ilglifosatocompetecolsubstratonaturale(PEP)perillegameall’enzimaEPSPS.NellepianteOGM,ilprodo3odeltransgeneEPSPS*nonlegailglifosatoeperme3elasopravvivenzadellapianta,anchesetra3ataconl’erbicidaglifosato.

- GenenptII:codificaperlaneomicinafosfotransferasi,conferisceresistenzaaglianHbioHciaminoglicosidici,comelakanamicinaelaneomicina.

- Genepat:codificaperlafosfinotricinaaceHl-trasferasiderivantedalloStreptomyces

viridochromogenes,cheinduceaceHlazioneedina5vazionedell’erbicidaglufosinate.- GeneCry:produceunaproteinapresadalBacillusthuringiensis,cheformaporinell’intesHno

dellalarva.- TerminatoreNOS:Terminatoreo3enutodalgenedellanopalinasintetasidiAgrobacterium

tumefaciens.

linkpertrovareinfosemenH:h3p://www.gmo-compass.org/eng/gmo/db/

5.4Protocollosperimentale

5.4.1EleUroforesisugeldiagarosio:soluzioniereagen4• tampone TBE (Tris-Borato-EDTA) 1x. Questo tampone si prepara facendo una diluizione 1:10dellasoluzione“madre”TBE10x,lacuicomposizioneè:

Tris108g(0,89M) acidoborico55g(0,89M) EDTA7.5g(0,02M)pH8,3 H2Oa1litroIlpH8,3vieneraggiuntoautomaHcamente.•DNAprodo5conlaPCR,giàpronH•marcatoredipesomolecolare(DNAdelplasmidepUC8tagliatoconl’enzimadirestrizioneHaeIII)•agarosioinpolvere(0.6g)•H2OdisHllata•Eurosafe• loadingdye6x,giàprontoineppendorfecontenente: bludibromofenolo0.25% xilenecianolo0.25% glicerolo30%

5.4.2PreparazionedelgeldiagarosioNotadi laboratorio: laconcentrazionediagarosiodelgelvienesceltadalricercatore inbasealledimensioni dei frammenH di DNA da separare. Nel nostro caso, dovendo separare frammenHlinearidiDNAcompresitra100e2.000bpsiuHlizzaungeldiagarosioal2%.

! 17

Normedilavoro:❑perchihaicapellilunghi:legarsiicapelliconunelasHco❑primadicominciarealavorare,lavarsilemani❑ primadi cominciare l’esperimento, lo studenteverrà familiarizzato con la strumentazione che

dovràuHlizzaare,inmodoparHcolareconlemicropipe3e

Operazionidasvolgereperlapreparazionedelgeldiagarosio:❑prelevare30mlditamponeTBE1xeme3erlonellabeutacontenentel’agarosio❑A3enzioneanonsprecareagarosio:costa600euroalchilo!❑pesarelabeutacontenentelasoluzionediagarosioesegnareilpesosulprotocollo:_______❑leggereaEentementela“Notadisicurezzasullau>lizzazionedelfornoamicroonde”❑scioglierel’agarosionelfornoamicroondeimpostatosullapotenzadi500Vper1minuto.Aprire

poi il forno a microonde, agitare delicatamente la soluzione con una presina, facendoa3enzione a non sco3arsi. Richiudere il forno a microonde e sciogliere la soluzione per unulterioreminutoallastessapotenza

❑ pesare la soluzione di agarosio (l’acqua del tampone, bollendo, è evaporata!) e riportare lasoluzionediagarosioalpesooriginale,uHlizzandounaspruzze3aconH2OdisHllata.A3enzione:far cadere l’acqua delicatamente, facendola scivolare lungo i bordi della beuta, altrimenH siformanodellebolle

❑prepararelavasche3aperele3roforesiconbordidi“nastroadesivodicarta”❑aspe3are3-5minuH,coprendolabeutacontenentelasoluzionediagarosioconunpezze3odi

stagnola, per evitare l’evaporazione. L’agarosio deve raggiungere una temperatura intorno ai60°C,altrimenHrovina il supportodiplasHcadellavasche3adell’ele3roforesi.Me3ere1μldiEuroSafe e agitare la beuta dolcemente. Quindi versare la soluzione di agarosio, evitando diformarebolle,nellavasche3aperele3roforesidoveègiàstato inserito ilpe5ne. Ipozze5siformanoquando,unavoltasolidificatoilgel,vienetoltoilpe5ne

❑lasciaresolidificareatemperaturaambientepercirca15min.Quandoilgelèsolidificatodiventaopaco

❑mentresiaspe3a lasolidificazionedelgel, faredelleprovedicaricamentodeipozze5delgel(12μldiloadingdye1x)sualtrigelgiàpronH

❑togliereilnastrodicartadallavasche3aeposizionarlanellacameradicorsa❑versareiltamponeTBE1xnellacameradicorsa(servonocirca200ml),evitandochesiformino

bolle.Sesiformanobolle,toglierledelicatamenteconunpuntale❑ togliere lentamente il pe5ne, tenendosi perpendicolare rispe3o al gel. I pozze5 che si sono

formaHnelgelhannounvolumedicirca15μl

5.4.3CorsaeleUrofore4ca

Operazionidasvolgereperlacorsaele6rofore8ca:

❑ aggiungere 2 µl di loading dye 10x a ciascuna prove3a contenente il DNA (o3enuto peramplificazione con la PCR). Risospendere con la micropipe3a, evitando di formare bolle. Ilglicerolopresentenel loadingdyeserveperrenderepiùdensa lasoluzionediDNAdacaricarenelpozze3oequindiafacilitarnel’entratanelpozze3o

❑sesiformanobolle,centrifugarebrevemente(1sec)inunamicrocentrifugaeppendorf(ingergodilaboratorio,sidice“spinnare”daspin,centrifugare)

❑leggereaEentementela“Notadisicurezzasullau>lizzazionedellacentrifuga”

❑posizionare lavasche3aper l’ele3roforesi suun foglionero,perchèsiapiù facile individuare ipozze5

! 18

❑ nel primo pozze3o a sinistra, caricare lentamente ilmarker di DNA a pesomolecolare noto;caricarepoiicampioni(12µl)da1a6,neipozze5successivi(ognipozze3ohaunvolumedi15µl), ponendosi con la punta della micropipe3a in un angolo del pozze3o e perpendicolarerispe3o al gel, facendo a3enzione a non bucare il fondo del pozze3o e a non far uscrie ilcampionefuoridalpozze3o

❑chiudereilcoperchiodellacellaele3roforeHca❑leggereaEentementela“Notadisicurezzasullau>lizzazionedell’apparatopereleEroforesi”❑collegareimorse5allacameradicorsaeaipolidelgeneratoredicorrente,de3oanchepowersupply;ilDNAècariconegaHvamenteemigraversoilpoloposiHvo

❑fissare il voltaggioalvalorecostantedi100Ve lasciareprocedere lacorsaele3roforeHcapercirca50min

❑ osservare la migrazione del loading dye per valutare la migrazione del DNA, che, essendoincolore,nonsipuòvedere.IlbludibromofenolomigraallastessavelocitàdiunframmentodiDNA a doppia elica di circa 300 bp,mentre lo xilene cianolomigra alla stessa velocità di unframmentodicirca4.000bp.A3enzione:lacorsaele3roforeHcadeveesserefermataquandoilbludibromofenolositrovaacirca1-2cmdallafinedelgel,inmododaevitarecheilDNAescadalgelstesso.Sedovessesuccedere,siperdonoicampionidiDNA!

Operazionidasvolgereallafinedella corsaele6rofore8ca.Questaoperazionevienesvoltadaltutor:

❑alterminedellacorsa,osservareilgelaltransilluminatore❑ documentare il risultato del gel, facendo una foto al gel (ricordarsi di portare unamacchina

fotograficadigitale!)

5.4.4InterpretazionedelrisultatodellacorsaeleUrofore4ca

PM: marcatore di peso molecolare corsia 1: DNA di mais non OGM (controllo negativo, contiene solo il gene della tubulina) corsia 2: DNA di mais OGM (controllo positivo con gene Bt e gene EPSPS) corsie 3: campionamenti corsia 8: bianco di PCR (costituito dalle stesse soluzioni e dagli stessi tamponi utilizzati, ma che non contiene DNA del campione. Serve per dimostrare l'assenza di DNA contaminante durante tutte le fasi di lavoro)

! 19

bianco

OGM- OGM+

campioni

Tubulina

BT

EPSPS

6.Normegeneralidisicurezzainlaboratorio

Qui di seguito sono elencate alcune norme elementari di sicurezza, che devono esseretassaHvamenterispe3ate.

❖ Entrandoinlaboratorio,individuareleviedifuga,indicatedallasegnaleHcaverde.❖ In laboratorio indossare sempre il camice. Il camice deve essere chiuso sul davanH, con

manichelungheepolsiniadelasHco.Alterminedellea5vità,primadilasciareillaboratorio,togliersi il camice. In ogni caso, non uscire dal laboratorio, per recarsi in altre aree(biblioteca,uffici,bar,ecc.),senzaaverprimatoltoilcamice.

❖ Nonintrodurreinlaboratorioborse,zainioaltromaterialenonnecessario.❖ Indossare guanH monouso durante la manipolazione di sangue o di materiale da esso

derivatononfissato.IguanHdevonoessererimossicona3enzioneesosHtuiHquandosonovisibilmente contaminaH. I guanH si sfilano rovesciandoli e vanno ge3aH negli apposiHcontenitori.

❖ Gli studenH che presentano dermaHH o altre lesioni sullemani, devono indossare guanHprote5viintu3elefasidilavoro.

❖ I guanH vanno tolH, quando si usino strumenH di qualsiasi natura (telefono, tasHera,strumenHscienHfici,maniglie,ecc.).IguanHusaHnonvannoriuHlizzaH.

❖ Lavare le mani rouHnariamente, immediatamente dopo la manipolazione di materialicontaminaHe, inognicaso,dopo lafinedellea5vità,anchequandosonostaH indossaH iguanH.Lavaresemprelemaniprimadilasciareillaboratorio.

❖ In laboratorio è vietato mangiare, bere, fumare, portare ogge5 alla bocca ed applicarecosmeHci.

❖ Nonpipe3aremaiconlabocca,mauHlizzareleappositepropipe3e.❖ NonappoggiarerecipienHcontenenHliquidibiologicivicinoalbordodelbancodilavoro.❖ Tu3o ilmateriale biologico d'origine umana (sangue, ecc.) deve essere considerato come

potenzialmenteinfe3oepertantotra3atoconlenecessarieprecauzioni.❖ Segnalare immediatamente al personale docente ogni spargimento dimateriale biologico

(ades.schizzidisangue)sulpianodilavoro,affinchésiprovvedaalladecontaminazioneconungermicidachimicoappropriato(candeggina,ecc.).

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SEME BT EPSPS feno4po

Maize(GA21)MON-ØØØ21-9[Syngenta]

mepsps Tolleranzaaerbicidaglifosato

Maize(MON810)MON-ØØ81Ø-6[Monsanto]

cry1A(b) Resistenzaalepido3eriinfestanH

Maize(NK603xMON810)MON-ØØ6Ø3-6xMON-ØØ81Ø-6[Monsanto]

cry1Ab cp4epsps Resistenzaalepido3eriinfestanHTolleranzaaerbicidaglifosato

TabelladellesemenHrealmenteincommercio

❖ Decontaminareepuliresempre,alterminedel lorouHlizzo, leapparecchiaturescienHfichee,alterminedellaa5vità,ipianidilavoro.

❖ Seguirescrupolosamenteleindicazionidisicurezzariportateneiprotocollidiesperimento.❖ Raccoglieretu5iliquidibiologici(sangue,terrenidicolturavenuHaconta3oconlecellule,

cellule,ecc.)inspecialicontenitoriperrifiuH,cheverrannosuccessivamenteeliminaHpreviotra3amentoconcandegginaal15%.

❖ Me3ere il materiale disposable (pipe3e, fiasche ecc.) venuto a conta3o con materialebiologicoinunsaccoapposito,cheverràsmalHtomedianteincenerimento.

❖ StanteicosHelevaHdellosmalHmento,ridurreilpiùpossibilel’usodelmaterialedisposable.❖ Segnalare immediatamente al personale docente qualsiasi incidente o la mancanza di

materialediprotezione

U4lizzodelfornoamicroonde

• nonaccendereilfornoseèvuoto• nonuHlizzareilfornoconmaterialiinfiammabili• non uHlizzare il forno con recipienH sigillaH (potrebbero esplodere): svitare i tappi delle

bo5glie,rimuovereicoperchi• nonuHlizzareilfornoconogge5metalliciometallizzaH:(es.bo5gliecopertedistagnola)e

concartad’argento• nonriempireeccessivamenteirecipienH:illiquidobollendo,potrebbetraboccare• proporzionarelapotenzaeiltempodiriscaldamentoalcontenutoinacquadiquantoviene

riscaldato.InparHcolare,nelcasodisoluzioniacquose,illiquidopotrebbesurriscaldarsioltreil punto di ebollizione, senza che appaiano bollicine. Ciò può portare al traboccamentoimprovvisodi liquidobollente.Perprevenirequestopericolo,mescolare il liquidoprimadiscaldarloelasciarloriposareperqualcheminutoprimaditogliereilrecipientedalforno

• uHlizzareiguanHimbo5HpertogliereirecipienHdalforno• dopol’usopulireilfornoconcartaspruzzatacondetersivopervetri• incasodiincendiodelcontenutodelforno,tenerechiusalaporta,spegnereilforno,staccare

laspinadallapresadicorrentelasciandocheilfuocosiesHnguapersoffocamento

U4lizzodellacentrifuga

• chiudere accuratamente il tappo delle prove3e, per evitare la fuoriuscita di liquido e laformazionediaerosol

• assicurarsi che il rotore sia bilanciato: prove3e di ugual peso devono essere inserite neglialloggiamenHdiametralmenteopposH

• chiudereilcoperchiodellacentrifugaprimadiavviarla• noncercarediaprireilcoperchioprimadelcompletoarrestodelrotore• incasodifuoriuscitadiliquidodalleprove3e,avverHreilpersonaledocente

U4lizzodell’apparecchiaturapereleUroforesi

• assicurarsichel’alimentatoresiaspento,primadicollegareimorse5• assicurarsicheilcoperchiodellavasche3asiacorre3amenteposizionato,primadicollegarei

morse5• alla fine della corsa, prima di rimuovere il coperchio della cella ele3roforeHca, spegnere

l’alimentatoreestaccareimorse5

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7.Quizdiautovalutazione

1. Completailbrano,scegliendotraiseguen>termini:

soma>che,diploidi,aploidi,poliploidi,germinali,embrione,spora,sessuali,mitosi,meiosi,game>,

cellulauovo,spermatozoo,zigote,aneuploidi,fecondazione

Nella maggior parte degli esseri vivenH, uomo compreso, le cellule del corpo, ossia lecellule…………, hanno un corredo cromosomico doppio e perciò sono de3e cellule…………..Mediante il processo di………………, alcune cellule cellule, de3e………….danno origine a celluleriprodu5veo………………Queste cellule si chiamano……………. e…………………, rispe5vamente nelmaschio e nella femmina. Queste cellule si fondono durante il processo della ………….. e dannoorigineallaprimacelluladelnuovoorganismo,de3a………….

2. IlDNAdell’uomoèdiversodaindividuoaindividuo,ecce3ochenelcasodi:A. maritoemoglieB. fratelloesorellaC. genitoriefigliD. gemellidizigoHciE. gemellimonozigoHci

3. QuestodisegnorappresentaunnucleoHde.DefiniscileparHA,BeC:

A…………………………….B……………………………C…………………………….

4. LedueemielichediunamolecoladiDNAsonoanHparallele.Questaaffermazionesignificache:

A. unaemielicahaladirezione5’P3’OHel’altra3’OH5’PB. i legami chimici che tengono uniH i nucleoHdi in ciascuna emielica sonodiversiC. ledueemielichesonocomplementariD. unasoladelledueemielichevienetrascri3aE. lareplicazionedelDNAèsemiconservaHva

5. Indicareilcorre3oordinedecrescentedidimensioni:A.gene,cromosoma,nucleoHde,codoneB.cromosoma,gene,codone,nucleoHdeC.nucleoHde,cromosoma,gene,codoneD.cromosoma,nucleoHde,gene,codoneE.gene,cromosoma,codone,nucleoHde

6. Gliistonisono:A. tra5diDNAspecificiperl’a3accodellapolimerasiB. proteinebasicheuHlizzatecomemarcatorinell’ele3roforesiC. proteinebasichecoinvoltenellaspiralizzazionedelDNAneicromosomiD. sequenzediDNAcodificanteparHcolariproteine

! 22

5

E. sequenzeripetutediDNA,chedeterminanopolimorfismoallelico

7.LadenaturazionedelDNAconsistenelladistruzione:A. deilegamitranucleoHdiadiacenHB. deilegamitrazuccherooebaseazotatadeinucleoHdiC. dellastru3uraadoppiaelicaD. dellasequenzanucleoHdicadelladoppiaelicaE. nessunadelleprecedenH

8. InunorganismocheproducegameHcontenenH32cromosomi,ilnumerodeicromosomicontenuHinunacellulasomaHcaè:

A. 16B. 32C. 4D. 64E. 8

9. Almicroscopioo5coèpossibileosservare:A. virusB. ribosomiC. proteineD. ba3eriE. molecoleinorganiche

10. DefiniteiseguenHtermini:

gene……………………………………………………………………………………locus……………………………………………………………………………………

11. InquestodiagrammadelprocessodireplicazionedelDNA,iquadraHninericontrassegnaHdaDedEsono:

� A.RNAiniziatore(primer)B.DNAfilamentostampo(templatestrand)C.frammenHdiOkazakiD.DNApolimerasiE.filamentodiDNAdinuovasintesi

12.LareplicazionedelDNA:(IdenHficarel’affermazionesbagliata)A. ècatalizzatadall’enzimaDNApolimerasiB. avvieneinmodosimileintu3elecelluleditu5gliorganismi

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C. richiedel’interventodinumerosienzimiD. necessitadellapresenzadiuninnescoaRNAE. avvienemedianteaggiuntadinucleoHdiindirezione3'→5'

13.LareplicazionesemiconservaHvadelDNAassicurachesianoprodo3e:A. due molecole idenHche di DNA, ognuna formata da una emielica giàesistenteedaunaemielicaneo-formataB. moltemolecolediRNA,dellequalisoloalcunematuranoaRNAmessaggeriC. qua3romolecolediDNA,dellequalisoloduevengonoconservateD. dueemielicheidenHchediDNA,ognunacomplementarealDNAstampoE. unasolaemielicadiDNA,copiandounosolodeiduefilamenHstampodiDNA

14.UnamolecoladiDNAèformatadaunfilamentocheinuncertotra3oècosHtuitodallaseguentesequenzanucleoHdica:5’ATCCATTGTGTCAATT3’Scriviquelladelfilamentocomplementare,indicandonelapolarità.

15. LaTaqpolimerasiè:A. unenzimacheintervienenellareplicazionedelDNAB. unenzimaestra3odaunba3eriotermofilo,usatonellereazionidellaPCRC. ilcolorantecheperme3edivisualizzarelebandediDNAnell’ele3roforesiD. l’enzimachefavoriscel’annealingdeiprimerneitermociclatoriE. unmarcatoredipesomolecolareusatonell’ele3roforesi

16. Glienzimidirestrizione:A. separanoladoppiaelicadiDNAneiduesingolifilamenHB. copianounaporzioneristre3adiDNAC. introduconogeniestraneinelDNAD. taglianoilDNAalivellodisequenzenucleoHdichespecificheE. eliminanotra5diDNA

17. Quale delle seguenH affermazioni riguardo all’ele3roforesi del DNA su gel diagarosioècorre3a?A. l’ele3roforesisugelseparalesingolebasiazotatedelDNAB. nelcorsodell’ele3roforesisugel i frammenHdiDNAmigranoverso l’ele3rodo

posiHvoacausadellalorocaricanegaHvaC. iframmenHpiùgrandidiDNAcopriranno,nellostessotempo,distanzemaggiori

nelgelrispe3oaiframmenHpiùpiccoliD. questatecnicaèusataperamplificareilDNAE. éunatecnicacheperme3editagliareilDNAinframmenH

18. Effe3uandol’ele3roforesidelDNAspiegate:a-qualecaricaassumeilDNAeacosaèdovutab-ilversodimigrazione

19. L’acronimoPCRstaper:……………………………………

! 24

20. La tecnica della PCR consiste di vari cicli di amplificazione della sequenza“bersaglio”diDNA.Ogniciclodiamplificazione,asuavolta,ècosHtuitodatrefasi.Indicarequali.

fase1:_______________________fase2:________________________fase3:_________________________

21. IprimeruHlizzaHnellaPCR:A. sonosequenzeripetutediDNAB. sonooligonucleoHdiritagliaHdaglienzimidirestrizioneC. peressereuHlizzabilidevonoesserepresenHmoltevoltenelfilamentodiDNAD. sono corte sequenze nucleotodiche arHficiali complementari al DNA da

amplificareE. cosHtuiscono i marcatori di peso molecolare usaH come riferimento

nell’ele3roforesi

22. ImarkersdipesomolecolareusaHnell’ele3roforesiperindividuarelalunghezzadeiframmenHdiDNAsonomisceledi:

A. molecole proteiche, a peso molecolare noto, che vengono fa3e migrare nellacellaele3roforeHcainsiemeaicampionidaanalizzareB.molecolediDNA,apesomolecolarenoto,chevengonofa3emigrarenellacella

ele3roforeHcainsiemeaicampionidaanalizzareC. variemolecole di DNA e proteine, a pesomolecolare noto, che vengono fa3e

migrarenellacellaele3roforeHcainsiemeaicampionidaanalizzareD.isotopiradioa5viusaHpermarcareiframmenHdiDNAdaanalizzareE. coloranH a peso molecolare noto che vengono fa3e migrare nella cella

ele3roforeHcainsiemeaicampionidaanalizzare

23.LatecnicadellaPCR:(IdenHficarel’affermazionesbagliata)A.necessitadielevatequanHtàdiDNAperpoterneeffe3uarel’amplificazioneB.consentediamplificareunaregionespecificadelgenomaC.sibasasull’uHlizzodidueprimerD.ècosHtuitadavariciclidiamplificazioneE.uHlizzaunaDNApolimerasitermostabile

24.UnadelleapplicazionidellatecnicadellaPCRè:A.idenHficazionedegliOGMB.idenHficazionedellapresenzadiunaproteinanelsangueC.separarazionedimolecolediDNAadestremitànoteD.determinazionedellacomposizioneinbasidiunamolecoladiDNAE. tagliodiunve3oreplasmidicoper la successivaclonazionediun frammentodi

DNA

25.Unorganismoincuièstatoinseritoungeneestraneoède3o:A.mutanteB.transgenicoC.traslocatoD.poliploideE.procarioHco

! 25

26.Ive3oridiclonaggio:(idenHficarel’affermazionesbagliata) A.nonpossonoreplicareilproprioDNAautonomamentedallacellulaospite

B.contengonounoopiùmarcatoridiselezioneC.contengonosiHdirestrizioneperl’inserimentodiDNAesogenoD.veicolanoilframmentodiDNAinessiinseritoE.devonoesserepresenHall’internodiunacellulaospiteperpotersipropagare

27.Qualeèladefinizionecorre3adeltermine“tecnologiadelDNAricombinante”:A. metodidiuHlizzazionespecificadicellulemodificateB. inserimentodiungeneinuncromosomaC. introduzionediungeneinunacellulaD. modificazionegeneHcadiunuovofecondatoodiungameteE.inserimentoedespressionedigeniestraneineiba3erioinaltriorganismi

28.NellatecnologiadelDNAricombinante,iltermineveEoresiriferiscea:A. l'enzimadirestrizionechetagliailDNAinframmenHB. l'estremitàdiunframmentodiDNAgeneratadaunenzimadirestrizioneC. unamolecoladiDNAusatapertrasferireDNAesogenoinunacellulaospiteD. unorganismoounacellulageneHcamentemodificatoE. unprimeruHlizzatonellatecnicadellaPCR

29.Unve3orediclonaggioplasmidicoè:(idenHficarel’affermazionesbagliata)A. conHeneunapropriaoriginedireplicazioneB. conHeneungeneperlaresistenzaadunanHbioHcoC. siintegranelcromosomaba3ericoricombinandosialivellodelsitodiclonazioneD. èunamolecoladiDNAincuièpossibileinserire,alivellodelsitodiclonazione,

unamolecoladiDNAesogenaE. èunamolecoladiDNAcircolareconsiHperenzimidirestrizioneconosciuH

30.RiempireglispazivuoH:A. LasiglaOGMstaper…..B. LepianteGMsonopianteincui,conletecnologiedelDNAricombinante,sono

staHintrodo5unoopiù………….provenienHdaaltriorganismivivenHC. LamaggiorpartedellepianteGMa3ualmentecolHvatesonostatemodificateal

finedirenderle………..

31.AnalizzoirisultaHdiunacorsaele3roforeHcanellaqualesonostaHcaricaH5pozze5nelseguente modo: 1=marcatore di PM, 2=campione, 3=controllo posiHvo, 4=controllonegaHvo,5=bianco.PossodirecheilDNAdelcampioneconHenematerialegeneHcamentemodificatose:

A. ilcampionepresentaunabandadiPMdiversodaquelladelcontrolloposiHvoB. ilcampione,ilcontrolloposiHvoeilbiancomostranounabandadellostessoPMC. ilcampione,ilcontrolloposiHvoeilcontrollonegaHvomostranolabandadiPM

a3esoD. ilcampioneeilcontrolloposiHvomostranolabandadiPMa3esoE. SoloilcontrolloposiHvopresentalabandadiPMa3eso

32.ElencaalmenoduemoHvipercuivengonoprodo3epianteGM.

33.PerprodurrepianteGMinlaboratorioènecessario:(idenHficarel’affermazionesbagliata)

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A. selezionareungeneuHleB. selezionarelepiantechehannoinseritoilgeneC. propagarelapiantaGMD. incrociare piante “selvaHche” selezionate per o3enere nuove varietà nella

progenieE. uHlizzareunve3oreba3ericoperinserireilgene“nuovo”nellecellulevegetali

34.Nellareazioneacatenadellapolimerasi(PCR),ilprimerhalafunzionedi:A.innescoacuisia3accalaDNA-polimerasiperiniziarelapolimerizzazionedelDNAB.indicareilprimonucleoHdedelDNAC.provocarelasuddivisionedelDNAD.a5vareilDNAE.a5vareinucleoHdi

35.LaPCRvieneuHlizzataper:A. o3enererapidamenteungrannumerodicopiediunsegmentospecificodiDNAB. frammentareilDNAC. duplicanrel’interocorredocromosomicoD. produrre in poco tempo una nuova colonia di cellule a parHre da una cellulaclonataE. o3enereungrannumerodienzimidallamedesimacopiadiDNA

36.NellaPCRilprimopassaggiodiognicicloèladenaturazioneadaltatemperaturadelDNA-stampo.Ladenaturazioneènecessariaper:

A.a5varelaDNApolimerasiB.separareiduefilamenHdelladoppiuaelicadelDNAC.perme3ereaideossiribonucleosiditrifosfaH(dNTP)diaccederealDNA-stampoD.volgereilDNAperconsenHreallasintesidiprocedereE. svolgere il DNA per consenHre ai filamenH complementari di riappaiarsicorre3amente

37.NeitermociclatorisiusaunapDNApolimerasitermostabileperché:A. èingradodifunzionareaqualsiasitemperaturaB. unisceifilamenHdiDNAadaltatemperaturaC. denaturailDNAD. generanuovienzimiE. nonperdelapropriaa5vitàquandoso3opostaasuccessiviciclididenaturazione

38. Quale delle seguenH affermazioni riguardo l’ele3roforesi del DNA su gel di agarosio ècorre3a?(Piùdiunarispostapuòesserecorre3a)

A. l’ele3roforesisugelseparalesingolebasiazotatedelDNAB. nel corso dell’ele3roforesi su gel i frammenHdiDNAmigrano verso l’ele3rodoposiHvoacausadellalorocaricanegaHvaC. iframmenHpiùgrandidiDNAcopriranno,nellostessotempo,distanzemaggiorinelgelrispe3oaiframmenHpiùpiccoliD. i frammenHpiù grandi diDNA copriranno, nello stesso tempo, distanzeminorinelgelrispe3oaiframmenHpiùpiccoliE. èunatecnicacheperme3ediseparareilDNAdalleproteine

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39.Completarelaseguentefrase:“Dalmomentoche ilDNAhacarica_________essomigraverso ilpolo________ inunacellaele3roforeHca”

A.posiHva,posiHvoB.posiHva,negaHvoC. negaHva,posiHvoD.negaHva,negaHvoE. neutra,neutro

40. Comesi faadeterminareseunapiantaètransgenica?(Piùdiunarispostapuòesserecorre3a)

A. si determina la sequenza nucleoHdica di tu3o il DNA della pianta e la siconfrontaconquelladiunapiantasicuramenteselvaHca(ossianontransgenica)B. siamplificaunasequenzadiDNAspecificadelcloroplastoC. siricercailprodo3oderivantedall'espressionedelgeneesogenoinseritoD. siusalatecnicadellaPCRE. siguardal’eHche3asulprodo3o

41.UnapiantageneHcamentemodificatasiproduce:A. trasferendoilnucleodaunacellulaadun’altraB. inserendonuovigeniinunacellulavegetalemedianteunopportunove3oreC. trasferendogenidaunacellulavegetaleadun’altraD. incrociandotraloropianteappartenenHaspeciediverseE. ilgenomadellapiantadamodificareinunplasmide

42.Peruncorre3ocampionamento,icampionivengonoselezionaHprelevando:A. un campione a caso nella matrice, indipendentemente dalla quanHta’ dimaterialedaesaminare

B. molH campioni uniformemente distribuiH nella matrice, e scegliendone uno acaso

C. molH campioni uniformemente distribuiH nella matrice, mescolandoli edestraendoneuncampione

D. molH campioni adiacenH nella matrice, mescolandoli ed estraendone uncampione

E.molHcampioniuniformementedistribuiHnellamatrice,eanalizzandolitu5

43.LametodicadanoiuHlizzataperl’idenHficazionediunOGMcomprendeleseguenHfasi.Indicarequaleèl’ordinecorre3o.

A. preparazione del campione, estrazione del DNA, amplificazione del DNA,ele3roforesidelDNAamplificato,valutazionedeirisultaHB. preparazionedelcampione,estrazionedelDNA,ele3roforesidelDNAestra3o,PCR,valutazionedeirisultaHC. preparazione del campione, estrazione della proteina, PCR, ele3roforesi delDNAricavatodallaproteinaestra3a,valutazionedeirisultaHD. preparazionedelcampione,PCR,ele3roforesidelDNAamplificato,valutazionedeirisultaHE. preparazionedelcampione,PCR,estrazionedelDNAdalmaterialeamplificatomediantePCR,ele3roforesidelDNA,valutazionedirisultaH

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44.PeresserecerHcheunapiantaègeneHcamentemodificata sipuò ricercare: (piùdiunarispostapuòesserecorre3a

A. nel suo fenoHpo la manifestazione di un cara3ere non Hpico della specie diappartenenzaB. nelsuoDNAlapresenzadelgenecherendel’organismoingradodiesprimereuncara3erenonHpicodellaspeciediappartenenzaC. nelsuoDNAungenepresentenelcloroplastooungenespecie–specificoD. nelsuofenoHpolamancatamanifestazionediuncara3erefavorevoleHpicodellaspeciediappartenenzaE. ilprodo3oderivantedall’espressionedelgeneinserito

45.Unorganismotransgenicoèunorganismo:(Indicarel’affermazionesbagliata)A. incuisonostaHintrodo5genidialtraspecieB. chehaacquisitonuovecara3erisHcheinseguitoall’inserimentodiuntransgeneC. creatoinlaboratorioD. generatodallafusionedidueorganismiE. incuisonostaHintrodo5geniestranei

Risposte

1.Nellamaggiorpartedegliesseriviven>,uomocompreso,lecelluledelcorpo,ossialecellulesoma8che,hannouncorredocromosomicodoppioeperciòsonodeEecellulediploidi.Medianteilprocessodimeiosi,alcunecellulecellule,deEegerminalidannoorigineacelluleriproduOveogame8.Questecellulesichiamanospermatozooecellulauovo, rispeOvamente nelmaschio e nella femmina. Queste cellule si fondono durante il processo della

fecondazioneedannoorigineallaprimacelluladelnuovoorganismo,deEazigote.2. E3. A.(baseazotata);B.(ribosioodesossiribosio);C.(gruppofosfato)4. A5. B6. C7. C8. D9. D

10.gene:unitàfunzionalediereditàchecorrispondeaunsegmentodiDNAchecodificaperunaproteinalocus:posizionefissasuuncromosomaoccupatadaundatogeneodaunsuoallele11. A12. E13. A14. 3’TAGGTAACACAGTTAA5’15. B16. D17. B18. a-IlDNAassumecaricanegaHvaperlapresenzadigruppifosfato

b-dalpolonegaHvoalpoloposiHvo19. PolymeraseChainReacHon20. Fase1:denaturazionedelDNA;fase2:appaiamento(annealing)deiprimer;fase3:sintesi(extension)diDNA21. D22. B23. A24. A25. B26. A

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27. E28. C29. C30. OrganismoGeneHcamenteModificato;Geni;resistenHaipesHcidi,oaidiserbanH31. D32. resistenzaaipesHcidi,resistenzaaidiserbanH,vaccini,valorenutrizionale33. D34.A

35.A36.B37.E38.BeD39.C40.CeD41.B42.C43.A44.AeBeE45.D

8.Glossario

Agarosio sostanza organica estratta da alcune alghe rosse e usata come gelificante

Allele una delle possibili forme alternative che un gene, localizzato in uno specifico sito cromosomico, può assumere

Annealing (appaiamento) formazione di molecole ibride di acidi nucleici basata sulla complementarietà delle basi

Aploide cellula o organismo con una sola copia di ciascun cromosoma dell’assetto (n)

Basi azotatemolecole costituenti il filamento del DNA insieme allo zucchero deossiribosio e al gruppo fosfato. Sono quattro e si classificano in basi puriniche (A e G) e pirimidiniche (T e C)

Batteri microorganismi unicellulari procariotici

Biotecnologie

utilizzo integrato della biochimica, della microbiologia e dell'ingegneria genetica, per produrre, a partire da organismi viventi (batteri, lieviti, cellule vegetali o animali di organismi semplici e complessi), quantità commerciali di prodotti utili, allo scopo di migliorare le caratteristiche di piante e animali, di sviluppare microrganismi utili per usi specifici o, ancora, di sviluppare nuovi strumenti terapeutici nell’uomo e nell’animale.

Campionamento estrarre campioni da una massa di un prodotto

Cellula unità elementare di un organismo pluricellulare ed essa stessa, come unità singola, un organismo elementare

Cellula germinale cellula aploide (n) deputata alla riproduzione (cellula uovo e spermatozoo).

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Cellula somaticacellula diploide (2n) destinata alla formazione del corpo (in greco “soma”) di un organismo e contrapposta a quella della linea germinale, deputata alla riproduzione.

Clonaggio ottenimento di infinite copie di un gene, mediante la sua introduzione in un vettore capace di replicare all’interno di un organismo ospite.

Cloroplasto organello cellulare che si trova esclusivamente nelle cellule vegetali e in alcuni protisti, deputato alla fotosintesi

Cromosomastruttura generalmente allungata, costituita da cromatina, visibile al microscopio ottico durante la divisione cellulare e contenente i geni in successione lineare.

Cromosomi omologhi coppie di cromosomi di forma generalmente simile, che contengono informazioni per gli stessi caratteri. Portano gli stessi geni, non necessariamente gli stessi alleli. Si appaiano alla meiosi.

Denaturazione

perdita della configurazione originale di una macromolecola, dovuta ad es. all’aumento di temperatura, a cambiamenti estremi di pH, a trattamenti chimici o altro; generalmente è accompagnata da una perdita dell’attività biologica. Nel caso del DNA, la denaturazione consiste nella separazione dei due filamenti della doppia elica, per rottura dei legami a idrogeno tra le basi azotate

Diploide cellula o organismo avente due copie di ciascun cromosoma dell’assetto (2n)

DNAabbreviazione di acido deossiribonucleico, macromolecola che costituisce il materiale genetico di tutti gli organismi (ad eccezione di alcuni virus). E’ costituito da due catene polinucleotidiche avvolte a doppia elica.

DNA polimerasi enzima che sintetizza DNA unendo insieme nucleotidi e usando un singolo filamento di DNA come stampo.

DNA ricombinante DNA costruito artificialmente unendo insieme segmenti nucleotidici provenienti da fonti diverse.

Elettroforesi tecnica che consente di separare molecole caricate elettricamente, mediante la migrazione in un campo elettrico

Enzimaproteina che catalizza (accelera) una specifica reazione chimica di una via metabolica in un sistema vivente. Ha azione specifica, in quanto riconosce il substrato su cui agire.

Enzimi di restrizione

chiamati anche endonucleasi di restrizione o “forbici” molecolari : sono enzimi che tagliano il DNA a doppia elica (e non quello a singolo filamento!) in corrispondenza di specifiche sequenze nucleotidiche, dette siti di restrizione.

Fenotipo Insieme delle caratteristiche visibili in un organismo che risultano dall’interazione tra genotipo e ambiente

Gemelli dizigoticigemelli derivati dalla fertilizzazione indipendente di due cellule uovo maturate contemporaneamente. La loro diversità genetica è equivalente a quella di due fratelli non gemelli

Gemelli monozigotici gemelli derivati da una singola cellula uovo, identici geneticamente

Gene unità funzionale di eredità che corrisponde di solito al segmento di DNA che codifica una proteina

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Supervisionedi:Prof.ssaM.L.Tenchini,DiparHmentodiBiologiaeGeneHcaper leScienzeMediche,UniversitàdegliStudidiMilano.Acuradi:

• Prof.ssaGiovannaViale,DiparHmentodiBiologiaeGeneHcaperleScienzeMediche,UniversitàdegliStudidiMilano;

• Prof.ssaFlaviaBerton,LiceoVico,Corsico• Prof.ssaSimonaCadirola,LiceoClassicoBerchet,Milano• Prof.ssaTizianaCalciolari,LiceoScienHficoEinstein,Milano• Prof.ssaM.TeresaOliveira,IPSIAFiocchi,Lecco• Prof.GiovanniPavone,IPSIAFiocchi,Lecco• Prof.ssaMarinaPorta,LiceoBanfi,Vimercate

Genoma patrimonio genetico di una cellula o di un organismo.

Genotipo costituzione genetica di un organismo

Istoni proteine basiche ricche in arginina e lisina che partecipano alla formazione del nucleosoma nei cromosomi eucariotici

Locus (pl. loci)posizione fissa su un cromosoma occupata da un dato gene. Nel linguaggio comune il termine viene spesso usato come sinonimo di gene.

Mutazionecambiamento del patrimonio genetico ereditabile, raro, improvviso e casuale; può verificarsi spontaneamente oppure essere indotto da agenti chimici o fisici.

Nucleotide unità base del DNA e dell'RNA, formato da gruppo fosfato, zucchero e base azotata

Oligonucleotidecorta molecola di DNA (o RNA) a singolo filamento, costituita da poche decine di basi, ottenuta artificialmente e utilizzata in esperimenti di ibridazione molecolare e nella PCR.

Organismo Geneticamente Modificato (OGM)

organismo il cui materiale genetico è stato modificato introducendo nuovo DNA o modificandone il genoma

PCR (polymerase chain reaction)

tecnica di biologia molecolare utilizzata per amplificare in breve tempo segmenti specifici di DNA

Plasmidepiccola molecola di DNA extracromosomico dei procarioti che si replica autonomamente e ha la capacità di trasferirsi da una cellula all’altra previa duplicazione

Polimorfismo esistenza di forme diverse. Può essere riferito a: alleli (polimorfismo allelico), proteine (polimorfismo proteico), DNA (polimorfismo del DNA).

Polinucleotide molecola costituita da più nucleotidi uniti da legami fosfodiesterici

Primer (innesco) oligonucleotide di DNA o RNA al quale vengono aggiunti nuovi nucleotidi nel corso della sintesi di DNA

Transgene gene esogeno introdotto, con le tecniche dell'ingegneria genetica, nel genoma di un organismo in modo da fargli acquisire caratteristiche nuove

Trasformazione processo attraverso il quale può essere trasferita informazione genetica da una cellula all'altra

Vettore in biotecnologia, un agente capace di trasferire informazione genetica da un organismo all’altro

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