Attualità sull’epidemiologia, la diagnosi e la profilassi delle infezioni da
Metapneumovirus aviare in Italia
Elena Catelli
Torino , 3 ottobre 2013
SEMINARIO IZS del Piemonte, Liguria e Valle D’Aosta
“MALATTIE RESPIRATORIO DEL POLLAME:Patogenesi, clinica, diagnosi, strategie vaccinali”
Malattie da Metapneumovirus Aviari (AMPV)
Agente eziologico della “Rinotracheite del Tacchino” (TRT)
Infezioni respiratorie nel pollo che possono esitare nella
“Sindrome della Testa Gonfia” (SHS)
R. C. Jones
Famiglia PARAMYXOVIRIDAESottofamiglia Pneumovirinae
Genere Metapneumovirus
Avian metapneumovirus Human metapneumovirus
Metapneumovirus Aviare (AMPV)
C.J Naylor
Metapneumovirus Aviare (AMPV)
RNA virus, singolo filamento, Genoma circa 13.000 b
FG
N
P M
M2
SH
L
4 sottotipi virali : A, B, C e D
Sottotipi virali….� A e e e e B
Identificati sulla base della sequenza del gene G nel 1994
� CCompare per la prima volta nel 1997 negli USA, differenze poligeniche, sierologiche e biologiche
� DIndividuato nel 2000, 2 ceppi francesi isolati nell’ 85, differenze poligeniche
Specie sensibiliEpidemiologia
� Tacchino
� Pollo
� Fagiano
� Faraona
� Anatra Muta
�…Altre spp?
CCAA -- BB
AA -- BB
AA -- BB
AA -- BB
DD
Non Presente
CC
CC
Compare alla fine degli anni ’70 in Sud Africa poi si diffonde in Europa, Medio Oriente…
�� Diffusione mondiale AMPV Diffusione mondiale AMPV
CC
�� AMPV IN ITALIAAMPV IN ITALIA
� 1987-88 prime segnalazioni
�Infezione endemica nelle aree a maggior vocazione avicola
� Prevalente AMPV sottotipo B
� AMPV Sottotipo A dal 2003
� Tutte le età
� > nei giovani
� Morbilità 100%
� Forma respiratoria
� Calo dell’ovodeposizione ed alterazioni del guscio nei riproduttori
� Complicazioni batteriche
“Rinotracheite del Tacchino” TRT
� Sintomatologia clinica
� Sintomatologia clinica - TRT
Scolo nasale
Scolo oculareschiumoso
Rigonfiamento seniinfraorbitali
La sintomatologia è aggravata da infezioni
batteriche concomitanti o secondarie:
�Mycoplasmi
� Escherichia coli,
�Ornithobacterium rhinotracheale
� etc.etc.
da fattori ambientali sfavorevoli: sovraffollamento, scarsa ventilazione, basse temperature etc.etc.
↑ la MORTALITA’
� Forme respiratorie + lievi (dopo la 4° sett di età)
� Cali dell’ovodeposizione negli animali in deposizione
� “Sindrome della testa gonfia”
Infezioni da Metapneumovirus nel POLLO
� Sintomatologia clinica
� Lesioni anatomopatologicheTacchino e pollo
Vie aeree superiori
• Rinite, sinusite e tracheite catarrale
• RARE lesioni polmonari o coinvolgimento dei sacchi aerei (se in assenza di infezioni secondarie)
� Sindrome della testa gonfia(SHS) nel Pollo
�Grave prostrazione
�Rigonfiamento edematoso del sottocute della faccia e testa
� Sindrome della testa gonfia(SHS) nel Pollo
�infezione da Metapneumovirus aviare o Coronavirus
� associata ad una componente batterica (E.coli)
� Sintomatologia clinica
altre specie…..
In FARAONE da carne
� Sintomatologia respiratorio
� Qualche soggetto con testa gonfia
� AMPV sottotipo B
� I sintomi e le lesioni non sono patognomonici
� E’ necessaria la conferma di LABORATORIO
Forme simili con …
�� Paramyxovirus 1Paramyxovirus 1 -- ceppi lentogeniceppi lentogeni
�� OrthomixovirusOrthomixovirus influenza a bassa patogenicitàinfluenza a bassa patogenicità
�� Infezioni daInfezioni da Mycoplasma gallisepticum Mycoplasma gallisepticum
�� Coronavirus della Bronchite infettiva (pollo) Coronavirus della Bronchite infettiva (pollo)
�� Etc. etc.Etc. etc.
�� DIAGNOSI DIAGNOSI
�Diagnosi DIRETTA
�Amplificazione del genoma virale � RT-PCR
� Real time RT-PCR
�Isolamento virale
�Evidenzare il virus� Tecniche immuno-enzimatiche
�Diagnosi INDIRETTA
�Test sierologici
�� DIAGNOSI DIAGNOSI
�� CAMPIONAMENTOCAMPIONAMENTO
MOMENTO CRITICO NELLA DIAGNOSIDIRETTA !
I. Il virus persiste per BREVE nell’ospiteII. I sintomi clinici si rendono evidenti dopo il
picco virale nei tessuti
012345678
titol
o vira
le
1 2 3 4 5 6 7 8 9
giorni post infezione
turbinati trachea
Replicazione di AMPV nei tessuti di tacchino
012345678
titol
o vira
le
1 2 3 4 5 6 7 8 9
giorni post infezione
turbinati trachea
Sintomatologia CLINICA
sintomi
Replicazione di AMPV nei tessuti di tacchino ….andamento della sintomatologia clinica
I. Campionare all’inizio della sintomatologia
II. Pool di campioni
�� CAMPIONAMENTOCAMPIONAMENTO
� Tamponi rino-faringei� 10 soggetti per gruppo
�� Diagnosi DIRETTADiagnosi DIRETTAAmplificazione del genoma virale
�RT-PCR
�Real Time RT-PCR
�Sensibili, specifiche, rapide�Anche da tamponi a secco�Il virus evidenziabile più a
lungo�tipizzazione virale (A, B, C e
D)
��Vantaggi tecniche molecolariVantaggi tecniche molecolari
� UNIVERSALI - in grado di evidenziano tutti i tipi conosciuti e possibili nuovi sottotipi….
A
BC
D
?
RT- PCR o real time RT-PCR
Protocolli disponibili
� SOTTOTIPO SPECIFICI - in grado di evidenziare un solo sottotipo
� in USA per sottotipo C
C
RT- PCR o real time RT-PCR
Protocolli disponibili
� SOTTOTIPO SPECIFICI - in grado di EVIDENZIARE e DISTINGUERE più sottotipi contemporaneamente
A
B
RT- PCR o real time RT-PCR
Protocolli disponibili
� IN ITALIA SOTTOTIPI A e B sono i prevalenti
� USATA IN ITALIA !
A
B
Naylor et al. 1997
Cecchinato et al., 2013
RT-PCR e RRT-PCR sottotipo A e B specifica
� DIFFERENZIARE e DISTINGUERE ceppi VACCINALI da ceppi SELVAGGI di AMPV sottotipo B
Listorti et al. 2012B
Vaccino
o selvaggio?
RT-PCR e RRT-PCR sottotipo A e B specifica+ analisi di restrizione enzimatica
Generalmente ritenuto impresa … ARDUA
�� Diagnosi DIRETTADiagnosi DIRETTAIsolamento virale
�Campioni di partenza: tamponi rinofaringei immersi in terreno di trasporto refrigerato
� Substrato di elezione per isolamento virale AMPV A e B �Organocolture di anelli tracheali di embrione
di Pollo
�� Diagnosi DIRETTADiagnosi DIRETTAIsolamento virale
Sezioni di tracheeSezioni di trachee
Organocolture dianelli tracheali di embrione di Pollo (TOC)
Osservazione battito ciliare Osservazione battito ciliare al microscopio rovesciatoal microscopio rovesciato
Inoculazione Organocolture
Epitelio ciliato integro
Rt-PCRReal time RT -PCR
IF
IF POSITIVA per AMPV
CILIOSTASIEpitelio e
ciglia distrutte
dopo 4- 10 gg
� Diagnosi INDIRETTA
�Test sierologici
�� DIAGNOSIDIAGNOSI
�Utile per evidenziare l’infezione
�Meno utile per la valutazione dell’ immunità
�� SIEROLOGIASIEROLOGIA
� Vari test disponibili
� ELISA: rapido, è il test di scelta
� ATTENZIONE AL SOTTOTIPO IMPIEGATO NEL KIT! sono meglio evidenziati anticorpi omologhi.
�� PROFILASSI VACCINALE PROFILASSI VACCINALE
� In commercio in Europa, dalla fine anni ’80 vaccini sottotipo A e B inattivati o vivi attenuati
� impiegati in
� tacchini da carne o riproduttori
� Polli riproduttori e ovaiole
�Non si vaccinano al momento i broilers
E importante il sottotipo utilizzato ?
Per i sottotipi A e BB , studi sperimentali suggeriscono che:
� esiste cross-protezione fra tali sottotipi
� la protezione eterologa è BUONA
� la omologa può essere MIGLIORE
�� PROFILASSI VACCINALE PROFILASSI VACCINALE
� Dipendono dall’ INDIRIZZO PRODUTTIVO
• CARNE Vaccini vivi attenuati � immunità locale per proteggere da forme respiratorie. Unica somministrazione spray in incubatoio.
• RIPRODUTTORI Vaccini vivi attenuati + inattivato �immunità umorale necessaria per proteggere dai cali della deposizione.
�� PIANI VACCINALI PIANI VACCINALI TACCHINITACCHINI
…Focolai di malattia si vedono ugualmente
Nonostante la vaccinazione…
Età dei tacchini in giorni
Positività ad AMPV B in %
0
20
40
60
80
2001 2002 2003 2004 2005 20060-21
22-42
43-90
Introduzione Introduzione vaccinazione a tappeto vaccinazione a tappeto
con sotottipo Bcon sotottipo B
�DISTRIBUZIONE % DELLE POSITIVITA’ AD AMPV IN RELAZIONE ALLA ETA’
Cosa succede in allevamento dopo vaccinazione?
Vaccino AMPV sottotipo sottotipo
in incubatoio A B
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
---------------------
Tamponi rinofaringei
RT-PCR per AMPV
Età al campionamento(settimane)
(due volte a settimana)
4 STUDI LONGITUDINALI - TACCHINI DA CARNE
---------------------
---------------------
---------------------
Vaccino AMPV sottotipo sottotipo
in incubatoio A B
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
---AAAA--------BB----
- = negativo
A = positivo AMPV-A
B = positivo AMPV-B
---AAAA---B----------
-----BBB--------B----
---BBBBB--------B----
Tamponi rinofaringei
RT-PCR per AMPV
Età al campionamento(settimane)
(due volte a settimana)
4 STUDI LONGITUDINALI - TACCHINI DA CARNE
Vaccino AMPV sottotipo sottotipo
in incubatoio A B
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
---AAAA--------BB----
- = negativo
A = positivo AMPV-A
B = positivo AMPV-B
---AAAA---B----------
-----BBB--------B----
---BBBBB--------B----
Tamponi rinofaringei
RT-PCR per AMPV
Età al campionamento(settimane)
(due volte a settimana)
4 STUDI LONGITUDINALI - TACCHINI DA CARNE
Non sempre sono associate A forma respiratoria
Vaccino AMPV sottotipo sottotipo
in incubatoio A B
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
---AAAA--------BB----
- = negativo
A = positivo AMPV-A
B = positivo AMPV-B
---AAAA---B----------
-----BBB--------B----
---BBBBB--------B----
Tamponi rinofaringei
RT-PCR per AMPV
Età al campionamento(settimane)
(due volte a settimana)
4 STUDI LONGITUDINALI - TACCHINI DA CARNE
Forme respiratorie!
Vaccino AMPV sottotipo sottotipo
in incubatoio A B
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
---AAAA--------BB----
---AAAA---B----------
-----BBB--------B----
---BBBBB--------B----
4 STUDI LONGITUDINALI - TACCHINI DA CARNE
Ceppi di origine vaccinale
Riacquisizione di patogenicità?
in campo
Vaccinazione di massa, non uniforme può facilitare retropassaggi del vaccino sino a
riacquisizione di virulenza
12345678
--
A-----
EtàIn settimane
A vaccino 1 giorno di vita
Ceppo AMPV 309/04
ISOLATO…
DIMOSTRATA LA ORIGINE VACCINALE
INOCULATO IN TACCHINOTTI
DIMOSTRATA LA VIRULENZA
� Reversione a virulenza del vaccino
Vaccini AMPV possono tornare
virulenti in condizione di campo e causare malattia
Vaccino APV sottotipo sottotipo
in incubatoio A B
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
---AAAA--------BB----
- = negativo
A = positivo APV-A
B = positivo APV-B
---AAAA---B----------
-----BBB--------B----
---BBBBB--------B----
Tamponi rinofaringei
per RT-PCREtà al campionamento(settimane)
(due volte a settimana)
4 STUDI LONGITUDINALI - TACCHINI DA CARNE
Vaccino APV sottotipo sottotipo
in incubatoio A B
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
---AAAA--------BB----
- = negativo
A = positivo APV-A
B = positivo APV-B
---AAAA---B----------
-----BBB--------B----
---BBBBB--------B----
Tamponi rinofaringei
per RT-PCREtà al campionamento(settimane)
(due volte a settimana)
4 STUDI LONGITUDINALI - TACCHINI DA CARNE
Si possono spiegare per Minore durata dellaimmunità crociata fra sottotipi
A vs B
Van de Zande et al, 1998
Vaccino APV sottotipo sottotipo
in incubatoio A B
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
---AAAA--------BB----
---AAAA---B----------
-----BBB--------B----
---BBBBB--------B----
Età al campionamento(settimane)
(due volte a settimana)
4 STUDI LONGITUDINALI - TACCHINI DA CARNE
Quale la ragione dell’incremento di focolai di TRT in animali vaccinati correttamente e con vaccino del medesimo sottotipo virale causa del
focolaio?
EVOLUZIONE GENOMICA ED ANTIGENICA DI AMPV PER ELUDERE LA RISPOSTA
IMMUNITARIA VACCINALE?
� Ragioni per mancata protezione B vs B
� Evoluzione GENOMICA AMPV sottotipo B
88
93
75
100
88
74
Albero filogenetico gene G
di ceppi AMPV italiani ed europei isolati dal 1986 AL 2007
pre-1994post-2000
� DUE CLUSTER (boostrap=100) : ceppi pre-1994 e ceppi post-2000
� C’è stata una evoluzione genomica dei ceppi italiani post-2000 tanto che essi sono nettamente distinti dai ceppi pre-1994 e dal vaccino.
� Presentano mutazioni che ne modificano i siti antigenici
� Ceppi recenti post -200 Inoculati in tacchini vaccinati causano una certa sintomatologia respiratoria.
� Evoluzione GENOMICA AMPV sottotipo B
I virus circolanti in Italia dal 2000
hanno avuto una evoluzione genetica ed antigenica…..
…Che nel tempo li ha resi in grado di
eludere protezione ed immunità indotte dal vaccino
In sintesi…un po’ una storia
• A partire da uno studio di campo per comprendere le “rotture vaccinali” osservate, mediante:
- Caratterizzazione molecolare dei ceppi- Prove sperimentali in vivo
• E’ stata dimostrata la– Reversione a virulenza del vaccino– Evoluzione di ceppi di recente isolamento tale da evadere l’
immunità vaccinale, legata con ogni probabilità alla pressione vaccinale
AMPV è un esempio:
� di come l’introduzione di vaccini abbia ridotto i danni legati alla malattia
�Ma influenzato la epidemiologia dei virus circolanti
� Importante monitorare con continuità il campo
�Per rispondere alle sfide emergenti
…che ci fa riflettere
Gruppo VERONESIGruppo VERONESI
� Giovanni Ortali� Emilio Morandini� Luigi Sperati Ruffoni� Patrizia Pesente
Università di BOLOGNAUniversità di BOLOGNA
� Caterina Lupini� Enrico Ricchizzi� Patrizia De Matteo � Mara Battilani� Valeria Listorti
Università di LIVERPOOLUniversità di LIVERPOOL
� Clive J Naylor� Richard C Jones� Paul A Brown� Carol Savage� Jayne Clubbe
Università di PADOVAUniversità di PADOVA
� Mattia Cecchinato
Ringraziamenti
Elena CatelliDipartimento di Scienze Mediche Veterinarie
www.unibo.it
Grazie per l’attenzione!
