Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1): elaborazione di...

Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero

(PRIS1):elaborazione di disciplinari per la

produzione di prodotti sementieri no OGM

Roma, 19 giugno 2007

ASPETTI ANALITICI

Rita ZecchinelliENSE – Laboratorio Analisi Sementi

Tavazzano (LO)

Laboratorio OGM:

verifica presenza di OGM in sementiconvenzionali (mais, soia)

•presenza / assenza•quantificazione•identificazione evento GM

•messa a punto di metodologie e protocolli•test di proficiency (circuito ISTA)•test di validazione (circuito ENGL/CRL)

E.N.S.E. Laboratorio Analisi Sementi, Tavazzano

(LO)

E.N.S.E. Laboratorio Analisi Sementi, Tavazzano

(LO)

2001:

ACCREDITAMENTO ISTA

2006:

AMPLIAMENTO A

ANALISI OGMANALISI VARIETALI

Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero (PRIS1)

SCOPO:SCOPO:definire protocolli di campionamento e definire protocolli di campionamento e analisi per verificare l’assenza di OGM analisi per verificare l’assenza di OGM nelle sementi.nelle sementi.

1° ANNO:

soia

2° ANNO:

mais

pomodorobarbabietola

patata

Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero(PRIS1)

CAMPIONAMENTO

PREPARAZIONE DEL CAMPIONE DI ANALISI

QUANTIFICAZIONE DNA

ANALISI QUALITATIVA, QUANTITATIVA:

RISULTATORISULTATO

ESTRAZIONE DEL DNA


soia

mais

1°

ANNO

DETECTION OGMSpecie largamente studiate a livello internazionale.

Disponibilità di protocolli validati.Disponibilità di materiali di riferimento.

Import di sementi da Paesi utilizzatori di OGM.

CONTROLLI SU TUTTE LE SEMENTI IMPIEGATE e PRODOTTE


pomodoro

barbabietola

2°

ANNO

DETECTION OGMEsperienze limitate.

Scarsa disponibilità di protocolli validati.Scarsa disponibilità di materiali di riferimento.

patata


2°

ANNO



patata

Mancanza di metodi standardizzati per il campionamento.Deperibilità, ingombro.

+


pomodoro

barbabietola

2°

ANNO



patata

Limitato import di sementi da paesi utilizzatori di OGM.

CONTROLLI A SONDAGGIO


CAMPIONAMENTO delle SEMENTICAMPIONAMENTO delle SEMENTI: i riferimenti

GAZZETTA UFFICIALE GAZZETTA UFFICIALE DELLA REPUBBLICA ITALIANADELLA REPUBBLICA ITALIANA

supplemento ordinario al n. 2 del 4 gennaio 1993

MINISTERO DELL’AGRICOLTURA E DELLE FORESTE

DECRETO MINISTERIALE 22 dicembre 1992

METODI UFFICIALI DI ANALISI PER LE SEMENTIMETODI UFFICIALI DI ANALISI PER LE SEMENTI

in corso di revisione: sottocommissione per i metodi ufficiali di analisi delle sementi

c/o MiPAF


SEMENTI: SEMENTI: CAMPIONAMENTOCAMPIONAMENTO- caratteristiche del lotto:

identificazione - omogeneità - dimensioni- strumenti:

sonde - campionatore automatico- modalità, in base a:

tipo confezioni- intensità, in base a:

dimensioni lotto, peso e n° confezioni- dimensione del campione (3000 semi), in base alla specie:

mais 1.500 g, soia 800 g, pomodoro 10 g, barbabietola 80 g (sementi confettate: 3.000 semi)- numero di aliquote: 5 per il laboratorio (analisi)

per il laboratorio (rianalisi) per altro laboratorio (revisione) da conservare per la ditta

SCOPO: ottenere un campione di

dimensioni adeguate, rappresentativo del lotto


CAMPIONAMENTO

P

R

O

T

O

C

O

L

L

O

1. Verificare le seguenti condizioni:a) Il lotto deve essere identificato da un cartellino di certificazione; per lotti non definitivamente certificati, è possibile effettuare il campionamento solo se si provvede ad effettuare una sigillatura provvisoria, con attribuzione di un numero di riferimento identificativo;b) il peso del lotto non deve superare quello massimo ammesso (N.B. ricordare che è consentita una tolleranza del 5%);c) il lotto deve essere accessibile in ogni sua parte;d) il lotto deve risultare omogeneo, almeno per le caratteristiche macroscopiche.2. Procedere al campionamento, utilizzando lo strumento e le modalità di campionamento indicate adatte al tipo di confezione e allo stato in cui si trova la semente.3. Effettuare un numero di campioni elementari almeno pari al minimo stabilito in base al peso unitario delle confezioni, al numero di confezioni che compongono il lotto o al peso totale del lotto.4. Miscelare i campioni elementari prelevati per ottenere il campione globale di peso minimo pari a 5 volte il peso minimo del campione di analisi per la specie interessata (mais: 1.500 g, soia: 800 g, pomodoro: 10 g, barbabietola: 80 g). Nel caso di sementi confettate, calcolare la dimensione del campione in base alle dimensioni dei confetti e stimare il peso minimo del campione in modo da garantire il prelievo di 3000 semi; incrementare il valore ottenuto del 10% a scopo di garanzia.5. Suddividere il campione globale in cinque aliquote, ciascuna in una busta di carta robusta e completata con le indicazioni relative al lotto campionato (specie, varietà, lotto, categoria, ditta, data).6. Compilare un verbale che descriva l’intervento effettuato.7. Consegnare un’aliquota e una copia del verbale al rappresentante della ditta presso la quale si effettua il campionamento.8. Confezionare adeguatamente i campioni, unendo copia dei verbali.9. Inviare i campioni al laboratorio di destinazione, evitando in ogni caso di lasciare il pacco incustodito o di delegare la spedizione ad altri.10. Effettuare l’invio prontamente, con il mezzo più rapido.

SEMENTI DI MAIS, SOIA, POMODORO, BARBABIETOLA


PATATAPATATA: CAMPIONAMENTO IN CAMPO: CAMPIONAMENTO IN CAMPO

- il campionamento in campo è preferibile perché consente di ottenere migliore rappresentatività;

- il momento ottimale è 10 giorni dopo la distruzione dei cespi;

- la dimensione del campione viene stabilita in base alla superficie della coltura (minimo: 400 tuberi);

- la raccolta del campione viene realizzata dall’intero appezzamento, in modo rappresentativo;

- viene prelevata una singola aliquota, ma è necessario garantire la possibilità di un ricampionamento.


CAMPIONAMENTO

P

R

O

T

O

C

O

L

L

O

TUBERI-SEME DI PATATA

1. Eseguire il prelievo in campo, almeno 10 giorni dopo la distruzione dei cespi.

2. Per appezzamenti di dimensioni sino a 4 ha: prelevare un numero di tuberi almeno pari a 400.

3. Per appezzamenti di dimensioni superiori a 4 ha e sino a 9,9 ha: prelevare un numero di tuberi almeno pari a 550.

4. Per appezzamenti di dimensioni pari a 10 ha o superiori: 110 tuberi in più ogni 5 ha.

5. Suddividere idealmente la superficie da campionare con un reticolo di dimensioni opportune, in modo da avere un numero di celle pari al numero di prelievi elementari.

6. Prelevare un tubero da ogni cella.

7. Scegliere tuberi di medio calibro.

8. Compilare un verbale che descriva l’intervento effettuato e che riporti tutte le informazioni relative alla partita e al coltivatore.

9. Acquisire una dichiarazione relativa alla destinazione della merce, al fine di consentire un eventuale ricampionamento.

10. Confezionare adeguatamente i campioni, unendo copia dei verbali.

11. Inviare i campioni al laboratorio di destinazione, evitando in ogni caso di lasciare il pacco incustodito o di delegare la spedizione ad altri.

12. Effettuare l’invio prontamente, con il mezzo più rapido.


PREPARAZIONE DEL CAMPIONE PREPARAZIONE DEL CAMPIONE DI ANALISIDI ANALISI

SCOPO – caratteristiche del campione di analisi: - dimensioni adeguate, in base al protocollo di analisi

- farina sufficientemente fine, sufficientemente omogenea- assenza di “contaminazioni”

Omogeneizzatore sterilmixer Mulino ZM200 Retsch


PREPARAZIONE DEL CAMPIONE DI ANALISIPROTOCOLLO

A. Ottenimento campioni/subcampioni di lavoro∙ Sementi:- 3.000 semi: unico campione o diversi subcampioni in base al protocollo

- tramite calcolo del peso dei 1.000 semi ∙ Tuberi-seme di patata:- minimo 400 tuberi: sbucciatura, 1 carotaggio/tubero (~1g) B. Macinazione- in base allo strumento disponibile- procedure di pulizia accurata - sementi confettate: deconfettare e lasciare seccare prima della macinazione- macinato di patata: conservazione del macinato liofilizzato o congelato a -20°C

le “contaminazioni” possono essere evitate se la proceduradi macinazione viene seguita scrupolosamente


ESTRAZIONE DEL DNAESTRAZIONE DEL DNA

SCOPO:OTTENERE DNA PURO E DI BUONA QUALITA’ PER LE ANALISI PCR

METODO:CTAB (cetyltrimethilammonium bromide)

RIFERIMENTO:“Foodstuffs - detection of genetically modified organism and derived products - nucleic acides extraction CEN”


ESTRAZIONE DEL DNAPROTOCOLLO

Tre fasi

- LISI della membrana cellulare con cattura di lipidi e proteine

- ESTRAZIONE con eliminazione di polisaccaridi, proteine, altro

- PRECIPITAZIONE e RISOSPENSIONE del DNA


QUANTIFICAZIONE DEL DNAQUANTIFICAZIONE DEL DNA

SCOPO:CONOSCERE QUANTITA’ E QUALITA’ DEL DNA ESTRATTO

METODO:SPETTROFOTOMETRICO

METODI ALTERNATIVI:FLUORIMETRIAQUANTIFICAZIONE SU GEL DI AGAROSIO

DILUIZIONI

CONCENTRAZIONEOTTIMALE (50 ng/μl)


QUANTIFICAZIONE DEL DNAPROTOCOLLI

A. Quantificazione del DNA su gel di agarosio- preparazione del gel di agarosio- lettura del gel con transilluminatore e stima della

concentrazione di DNA per confronto con campione di

riferimento

B. Quantificazione del DNA con spettrofotometro- calibrazione: lettura della soluzione di riferimento e del

“bianco” a λ= 260 nm e a λ= 320 nm- lettura del campione e del “bianco” a λ= 260 nm e a λ= 320

nm- calcolo:[assorbanza a 260 nm (OD) - assorbanza a 320 nm

(background)] x fattore di diluizione x fattore di conversione


ANALISI QUALITATIVA E QUANTITATIVAANALISI QUALITATIVA E QUANTITATIVASCOPO:EVIDENZIARE, QUANTIFICARE L’EVENTUALE PRESENZA DI OGM IN SEMENTI CONVENZIONALI.

SCOPO COMPLEMENTARE:IDENTIFICARE L’EVENTO OGM PRESENTE.

ANALISI SU SEMENTI

- matrice unica e nota- campioni di grandi dimensioni- presenza di OGM limitata - omogeneizzazione necessaria


ANALISI QUALITATIVA E QUANTITATIVAANALISI QUALITATIVA E QUANTITATIVA

Approccio privilegiato:analisi del DNA

PCR - REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI

PCRtramite amplificazione specifica, genera milioni di copie identiche di una singolasequenza di DNA


Denaturazione

Annealing

Extension


ANALISI QUALITATIVAANALISI QUALITATIVA

Risultato:elettroforesi su gel di agarosioconfronto con standard

Sonda TaqMan

ANALISI QUANTITATIVAANALISI QUANTITATIVA


ANALISI QUANTITATIVAANALISI QUANTITATIVA


LA CASSETTA OGM

Promotore Gene di interesse Terminatore

35S NOS“Gene funzionale”

DNA della pianta

DNA dellapianta



SPECIE EVENTO GENE D’INTERESSE STATUS NOTIFICANTE VARIETÀ ISCRITTE

Mais MON810 gene cry1Ab (resistenza insetti: lepidotteri)

Autorizzata 90/220/CEE con Decisione 98/294/CE

Monsanto 47 ES: 36 FR: 6 DE: 5

Mais Bt176 gene bar (resistenza insetti: lepidotteri)

Autorizzato 90/220/CEE con decisione 97/98/CEIscritta al registro degli alimenti

Ciba-Geigy 0

Mais T25 gene pat (tolleranza agli erbicidi)


Agrevo 0

Colza MS1/RF1 Gene bar (tolleranza agli erbicidi glufosinato)


Bayer Cropscience

0

Colza MS1/RF2 Gene bar (tolleranza agli erbicidi glufosinato)


Agrevo 0

Tabacco ITB 1000 OX Gene bxn (tolleranza agli erbicidi)


Seita 0

EVENTI AUTORIZZATI IN UE PER LA COLTIVAZIONE

EVENTI IN CORSO DI AUTORIZZAZIONE PER LA COLTIVAZIONE:mais 6, soia 1, colza 1 Fonte: http://www.consigliodirittigenetici.org/agrobiotech/notifiche_tutto.php

Eventi OGM di pomodoro


Eventop35S tNOS

Varietà commerciale

Produttore Caratteristiche Paesi

1345-4 + + -DNA Plant Tecnology corporation

Ritardo nella maturazione (riduzione dell'accumulo di etilene) mediante l'inserimento del gene troncato ACC sintasi

Canada, Messico, USA

35 1 N - - - Agritope Inc.

Ritardo nella maturazione (degradazione di un precursore dell'etilene) mediante l'introduzione di un gene che codifica per l'enzima S-adenosilmetionina idrolasi.

USA

5345 + + - Monsanto Company

Resistenza ai lepidotteri mediante l'inserimento del gene cry1Ac dal Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki.

Canada, USA

CGN-89322-3 (8338) + - - Monsanto Company

Ritardo nella maturazione (degradazione di un precursore dell'etilene) mediante l'introduzione di un gene che codifica per l'enzima ACC deaminasi.

USA

B, Da, F + + - Zeneca Seed

Ritardo della degradazione pectinica (riduzione dell'espressione della poligalatturonasi endogena) mediante l'inserimento di un gene (senso o antisenso) troncato che codifica per la PG.

Canada, Messico, USA

CGN-89564-2 (FLAVR SAVR) + -

Flavr Savr

Calgene Inc.

Ritardo della degradazione pectinica (riduzione dell'espressione della poligalatturonasi endogena) mediante l'inserimento di un'altra copia del gene antisenso che codifica per la PG.

Canada, Giappone, Messico, USA

Fonte: www.agbios.com/dbase.php

Eventi OGM di barbabietola da zucchero


Evento p35S tNOSVarietà

commerciale Produttore Caratteristiche Paese

GTSB77 + - InVigor™Novartis Seed

Monsanto Company

Tollerante al glifosate, mediante l'inserimento di un gene che codifica per l'enzima EPSPS isolato dal ceppo CP4 di Agrobacterium tumefaciens.

Australia, Giappone, Filippine, Usa

H7-1 - - - Monsanto Company

Tollerante al glifosate, mediante l'inserimento di un gene che codifica per l'enzima EPSPS isolato dal ceppo CP4 di Agrobacterium tumefaciens.Campioni standard certificati IRMM disponibili.

Australia, Canada, Giappone, Corea,

Filippine, Usa

T120-7 + - -

Bayer CropScience

(Aventis CropScience(A

grEvo))

Tollerante all'erbicida fosfinotricina (PPT) mediante l'inserimento di un gene, isolato da fungo Streptomyces viridochromogenes, che codifica per l'enzima PAT detossificando l'erbicida.

Canada, Giappone, USA.


Eventi

OGM

di patata


Evento p35S tNOSVarietà

commerciale Produttore Caratteristche Paese

ATBT04-6, ATBT04-27, ATBT04-30, ATBT04-31, ATBT04-36, SPBT02-5, SPBT02-7

+ +Atlantic and

Superior NewLeaf®

Monsanto Company

Resistente alla dorifora mediante inserimento del gene cry3a da Bacillus thuringensis subsp. tenebrionis


Filippine, Usa

BT6, BT10, BT12, BT16, BT17, BT18,

BT23

+ +Russet Burbank

NewLeaf®Monsanto Company

Resistente alla dorifora mediante inserimento del gene cry3a da Bacillus thuringensis subsp. tenebrionis

Canada, Giappone, Corea, Filippine,

Messico, Usa

RBMT15-101, SEMT15-02, SEMT15-15

- + NewLeaf® YMonsanto Company

Resistente alla dorifora mediante inserimento del gene cry3a da Bacillus thuringensis subsp. tenebrionis. Resistente a PVY (virus Y della patata) mediante inserzione del DNA codificante la proteina del capsidio


Filippine, Usa

RBMT21-129, RBMT21-350, RBMT22-082

- +Russet Burbank NewLeaf® Plus

Monsanto Company

Resistente alla dorifora mediante inserimento del gene cry3a da Bacillus thuringensis. Resistente a PLRV (RNA virus dell'accartocciamento fogliare della patata) mediante inserzione del DNA codificante la replicasi virale

Australia, Canada, Giappone, Corea, Filippine, Messico,

Usa

EH92-527-1 - + - BASF Amylogene

Contenuto di amilopectina superiore al 98%, mediante l'introduzione del gene antisenso gbss che inibisce la produzione di amilosio. Campioni standard certificati IRMM disponibili.

UK (Codice BPS-25271-9,

12/0705)



Mais, soia:PCR REAL TIME

IL PROTOCOLLO MESSO A PUNTO:- è mirato a verifiche su grandi numeri - può richiedere modifiche, in base alle strumentazioni disponibili- prevede uno screening con ricerca di p35S e tNOS- include 2 sub-campioni per ogni campione (estrazioni indipendenti)- include 3 repliche per ogni estratto- può essere completato con l’identificazione degli eventi OGM presenti nei campioni positivi- prevede procedure che diminuiscono i rischi di errore - include uno schema dei possibili errori e delle azioni correttive necessarie- prevede analisi “multiplex”- prevede il “protocollo termico” e fornisce indicazioni sul “protocollo di piastra”- prevede l’utilizzo di campioni standard di riferimento certificati per la costruzione di una curva di calibrazione con 5 punti- considera il gene endogeno di riferimento- prevede parametri per verificare l’esito della PCR (R2, slope)- prevede parametri per la verifica dell’attendibilità del risultato (CV su 6 repl.)


Pomodoro, patata, barbabietola:PCR QUALITATIVA

IL PROTOCOLLO MESSO A PUNTO:-è mirato a verifiche per sondaggio-può richiedere modifiche, in base alle strumentazioni disponibili-prevede uno screening con ricerca del p35S e/o tNOS- include i riferimenti ai metodi validati per gli eventi privi di p35S e tNOS (barbabietola H7-1 e patata EH92-527-1)- include 2 sub-campioni per ogni campione (estrazioni indipendenti)- include 2 repliche per ogni estratto- prevede la verifica dell’amplificabilità del DNA (geni endogeni di riferimento)- prevede procedure che diminuiscono i rischi di errore - include uno schema dei possibili errori e delle azioni correttive necessarie


Amplificazione con primer trnLc-trnLd (cloroplasto)

lane 2-3-4: pomodoro lane 5-6-7: barbabietola lane 8: patata lane 9: mais lane 10: soia lane 11: controllo negativo di amplificazionelane 1,12: marcatori di peso molecolare

Azioni di innovazione e ricerca a supporto del Piano Sementiero

(PRIS1)

TOF-TOR in pomodoro

tomatina: +

M +- NTC M


p35S: neg. p35S: pos.M+-

NTC

p35S in pomodoro

Staff laboratorio OGM: D.ssa Elena Perri - responsabile scientifico

D.ssa Maria Losi - ricercatriceD.ssa Vanna Losi - ricercatrice

D.ssa Daniela Villa – ricercatriceDr. Simone Garavelloni – assegno di ricerca

P.A. Carlo Tamagni - tecnico

Grazie!Grazie!


Date post:	02-May-2015
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