Caratterizzazione microbiologica e metagenomica di compost
Massimo Zaccardelli, Catello Pane, Riccardo Scotti
CREA-Centro di ricerca Orticoltura e Florovivaismo Pontecagnano (SA)
Portici, 15 giugno 2018
È la capacità di un compost di limitare lo sviluppo di malattie fungine o batteriche in presenza della pianta ospite
Meccanismi della Soppressività
► Azione diretta di sostanze antifungine proprie dei compost
►Incremento della competizione per lo spazio e i nutrienti a discapito dei patogeni ►Rilascio di composti fungitossici, antibiotici, HCN, VOCs, siderofori ed enzimi idrolitici da parte dei microrganismi antagonisti
►Induzione della resistenza sistemica nelle piante ospiti
ANTAGONISTA È un microrganismo, batterio o fungo, in grado di contrastare un patogeno.
►Parassitismo diretto
Portici, 15 giugno 2018
Meccanismi della Soppressività
Direct mechanisms Indirect mechanisms
Portici, 15 giugno 2018
NON Sterilizzato Sterilizzato (autoclavato)
Quando si sterilizza con il calore un compost soppressivo, quest’ultimo generalmente perde la soppressività
Portici, 15 giugno 2018
CTRL INOC C1 (p.+i.) C4 (p.) C5 (forsu) CC (c.) CCF (c.+f.)
st. st. st. st. st.
La Soppressività dei compost
Portici, 15 giugno 2018
Not inoculated CTRL
InoculatedCTRL
InoculatedNot sterile Compost
InoculatedSterile
Compost
Crescione /Sclerotinia minor
Es. compost da posa di caffè
Portici, 15 giugno 2018
Numerosi tipi di microrganismi antagonisti accrescono la soppressività del compost. Tra questi in particolare ci sono molti funghi − Trichoderma sp
O da batteri come
− Pseudomonas sp − Bacillus sp − Streptomyces sp
Principali microrganismi colturabili noti ai quali è attribuito in ruolo attivo nei compost soppressivi
Portici, 15 giugno 2018
Selezione di batteri antagonisti
Aloni di inibizioni in pastre Petri tra il fungo fitopatogeno e i batteri
produttore di sostanze antifungine diffusibili
Fungo
Batteri
Portici, 15 giugno 2018
0
10
20
30
40
50
60
70
1 6 11 16 21 26 31
P2, residui disoleati P1, residui non disoleati
Rivoltamenti
Tem
pera
tura
°C
Fase attiva (giorni)
Fase Attiva (30 gg) Fase di Maturazione (60 gg)
Compostaggio e temperature
Portici, 15 giugno 2018
Lactuca sativa / Sclerotinia minor
Brassica oleracea / Rhizoctonia solani
Solanum tuberosum / Fusarium solani
Saggio in vivo di batteri sporigeni isolati da compost
Portici, 15 giugno 2018
Microrganismi antagonisti/PGPR
A sinistra pomodoro inoculato con un Bacillus PGPR
Portici, 15 giugno 2018
Compost nella difesa dalle malattie telluriche
Portici, 15 giugno 2018
Control of Corky root of tomato
Pseu
dom
onas
(CFU
104
g-1)
0
50
100
150
200
250
300 6
5
4
3
2
1
0
Spor
e-fo
rmin
gba
cter
ia(C
FU 1
06g-1
)
C15 MINC45 CNT C15 MINC45 CNT
March April May June JulyMarch April May June July
Pseu
dom
onas
(CFU
104
g-1)
0
50
100
150
200
250
300 6
5
4
3
2
1
0
Spor
e-fo
rmin
gba
cter
ia(C
FU 1
06g-1
)
C15 MINC45 CNT C15 MINC45 CNT
March April May June JulyMarch April May June JulyMarch April May June JulyMarch April May June July
0
1
2
3
4
CNT MIN C15 C45
Treatments
Dis
ease
Seve
rity
0
1
2
3
4
CNT MIN C15 C45
Treatments
Dis
ease
Seve
rity
Control Compost
Examples
Portici, 15 giugno 2018
“CarbOnFarm”
Portici, 15 giugno 2018
Soppressività dei compost CarbOnFarm
0
25
50
75
100
L1 L2 L3
L7-8
TO M
.P.
S.S.
TO
L1A L4 CV
L2A
L3A
L4A
L5/6
A
L7A
RhizoctoniaSclerotinia
Inci
denz
a di
pia
ntin
e m
alat
e (%
)
* * Compost
Con sono indicati i compost capaci di controllare completamente Sclerotinia minor su Lepidium * Con x sono indicati i compost incapaci di controllare Rhizoctonia solani su Lepidium
X X X
Portici, 15 giugno 2018
Caratteristiche microbiologiche dei compost
Batteri Totali
Funghi Totali
L1 8,59 4,67L2 7,78 4,23L3 7,48 5,92L7-8 7,59 6,36L2C 6,98 4,56L7A 5,88 5,23L1A 7,98 6,00L4 12,56 5,15L2A 6,76 3,30L3A 6,62 4,00L4A 8,12 5,96L5/6A 8,16 5,19CV 6,21 4,78S.S. TO 6,00 3,85TO M.P. 8,78 4,19
Compost(Log10 u.f.c. g-1)
Portici, 15 giugno 2018
Caratteristiche microbiologiche dei compost
Portici, 15 giugno 2018
Enterobatteri Clostridi E. coli Salmonella Streptococchi
L1 0 0 0 0 15,0 0,9 0L2 0 4,48 0 0 9,5 4,5 0L3 0 4,00 0 0 25,0 4,5 0L7-8 0 3,68 0 0 9,5 4,5 0L1A 0 2,60 0 0 9,5 0,4 0L4 0 0 0 0 140,0 45,0 0L2A 0 3,73 0 0 0,9 0,4 0L3A 0 3,38 0 0 0 0 0L4A 0 3,78 0 0 0,4 0 0L5/6A 0 0 0 0 7,5 2,5 0L7A 0 3,24 0 0 9,5 0,9 0L2C 0 2,52 0 0 9,5 0 0CV 0 0 0 0 9,5 0 0S.S. TO 0 0 0 0 4,5 0,9 0TO M.P. 0 0 0 0 4,5 0 0
Compost(M.P.N./g)(Log10 u.f.c./g)
Coliformi fecali
Coliformi totali
Caratteristiche microbiologiche dei compost
Portici, 15 giugno 2018
Selezione di batteri termoresistenti potenzialmente antagonisti
Portici, 15 giugno 2018
Soppressività in vivo
Portici, 15 giugno 2018
Sostanze antibiotiche prodotte dai Bacillus spp.
2. Bacilisina
1. Surfactina
3. Iturina
5. Fengicina
4. Bacillomicina-D
Patogeni target Botritis cynerea Sclerotinia sclerotiorum Fusarium graminearum Penicillium expansum Rhizoctonia solani
1 2 3 4 5 MW
Portici, 15 giugno 2018
Codice ceppo Denominazione
Specie
8 P6i Bacillus subtilis 16 P8o Brevibacterium haloterans
19 P9b Bacillus subtilis
20 P9d Bacillus amyloliquefaciens
25 P10e Brevibacterium haloterans
26 P10f Bacillus subtilis
30 P11f Bacillus amyloliquefaciens
Identificazione mediante sequenziamento del 16S r-DNA
Portici, 15 giugno 2018
Trichoderma atroviride (10 isolati); Trichoderma harzianum (3 isolati); Trichoderma longibrachiatum (2 isolati)
I compost sono fonte di microrganismi agenti di biocontrollo
Portici, 15 giugno 2018
T Rs
Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP)
• L’analisi si basa sulla digestione, con enzimi four-cutter, di prodotti di PCR ottenuti utilizzando un oligo marcato con fluoroforo (es. FAM, HEX).
• La tecnica fornisce informazioni circa la diversità presente nel microbioma di un determinato campione.
• Il risultato di tale tecnica è un elettroferogramma che descrive un profilo di diversità della comunità microbica in relazione all’altezza ed ampiezza dei picchi presenti nel grafico.
Portici, 15 giugno 2018
Portici, 15 giugno 2018
Calcolo degli indici di biodiversità
dove:
Tipayno et al., Applied Soil Ecology 61 (2012) 137– 146
Risultati analisi T-RLFPs
Compost
Indi
ci d
i bio
dive
rsità
Portici, 15 giugno 2018
Risultati analisi T-RLFPs
Portici, 15 giugno 2018
La differenziazione delle comunità microbiche sulla base della struttura genetica osservata, non ha mostrato rela zioni significative con la funzione soppressiva misurata Pertanto, lo studio ha indicato che nei compost ha prevalso un modello di soppressività generale
0
25
50
75
100L1 L2 L3
L7-8
TO M
.P.
S.S.
TO
L1A L4 CV
L2A
L3A
L4A
L5/6
A
L7A
RhizoctoniaSclerotinia
Inci
denz
a di
pia
ntin
e m
alat
e (%
)
* *
La Soppressività dei compost
Portici, 15 giugno 2018
Compost A Compost B
+ suppressive - suppressive 4 different samples of compost 4 different samples of compost
CarbOnFarm composts
Next Generation Sequencing dei due compost L5/6A e L2A rispettivamente molto soppressivo e poco soppressivo
Portici, 15 giugno 2018
Lo studio della soppressività dei compost basato sull’isolamento di microrganismi in substrati selettivi ha dei grossi limiti perché:
solo il 5% dei microrganismi è colturabile in vitro
Metagenomica
Coltivazione dei microrganismi e Metagenomica
Portici, 15 giugno 2018
Sequencing 16S, V3-V4 region •Archea •Bacteria 18S, NS1-NS2 region •Fungi •Plantae Whole genome shotgun •Functional annotation
•16S amplicon sequencing, V3 and V4 region (2 x 300 bp,V3, paired-end) on Illumina MiSeq platform, 1.5 M reads.
•18S amplicon (NS1 and NS2 region) sequencing, (2 x 300bp,V3, paired-end) on Illumina MiSeq platform, 1.5bM reads.
•Single sequencing (2x300bp,V3, paired-end,10.000.000 reads/sample) on Illumina MiSeq platform.
Metagenomica di compost
Portici, 15 giugno 2018
Collaboration with European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI)
www.ebi.ac.uk
Portici, 15 giugno 2018
Identificazione dei microorganism
Analisi bioinformatica MiSeq - Illumina
Amplificazione di una regione del 16 S r-DNA
Studio di compost soppressivi mediante la Metagenomica
Sequenziamento
Portici, 15 giugno 2018
16S Taxonomy
Phylum level Other phyla
Acidobacteria
Gemmatimonadetes
Verrucomicrobia
Chloroflexi
Firmicutes
Deinococcus-Thermus
Planctomycetes
Actinobacteria
Bacteroidetes
Proteobacteria
L2A (B) L5/6 (A)
25
75
50
100
0
Rel
ativ
e ab
unda
nce
(%)
0 20 40
Compost L2ACompost L5/6A
Relative abundance (%)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
HS LS
•Higher percentage of Proteobacteria and Bacteroidetes in HS C
•Higher percentage of Planctomycetes in compost B
•Gemmatimonadetes, Verrucomicrobia and Acidobacteria in LS C
Portici, 15 giugno 2018
16S Taxonomy Genus level
4-4.99 3-3.99 2-2.99 1-1.99 0-0.99
L2A L5/6A
2 4 6 8 2 4 6 8 0 0 Log2 FoldChange Log2 FoldChange
Genus Relative abundance (%)
Compost
Nocardiopsis Glycomyces Streptomyces Galbibacter Parapedobacter Flavobacterium Arenibacter Planktosalinus Sphingobacterium Pedobacter Mariniradius Pricia Truepera Rhodopirellula Blastopirellula Luteimonas Pseudomonas Paracoccus Pseudofulvimonas Pedomicrobium
α = Actinobacteria; β = Bacteroidetes; δ = Deinococcus-Thermus; κ = Planctomycetes; π = Proteobacteria
α
β
δ
κ
π
*
*
* *
*
* *
* *
* *
* *
* *
* *
*
* = padj < 0.05
HS
Portici, 15 giugno 2018
LS
18S Taxonomy Phylum level
Unclassified
Other phyla
Arthropoda
Cryptomycota
Mucoromycota
Ascomycota
Basidiomycota
L2A LS
L5/6A HS
25
75
50
100
0
Rel
ativ
e ab
unda
nce
(%)
0 20 40
Compost L2ACompost L5/6A
Relative abundance (%)
*
*
*
*
•Few differences at phylum level for the 18S
Portici, 15 giugno 2018
Biological process Molecular function WGS functional analysis
L5/6A HS L2A LS
Portici, 15 giugno 2018
Compost soppressiveness
Direct antifungal activity
Filter-sterilized exstracts from composts
Portici, 15 giugno 2018
Disease suppressive assays 13C NMR spectra
ppm 0255075100125150175
Car
boxy
licC
Phen
olic
C
Arom
atic
C
O-a
lkyl
C
CH
3O/C
N
Alky
lC
C1
C4
C5
CC
CCF
ppm 0255075100125150175
Car
boxy
licC
Phen
olic
C
Arom
atic
C
O-a
lkyl
C
CH
3O/C
N
Alky
lC
C1
C4
C5
CC
CCF
Pane et al., (2013), Applied Soil Ecology 65: 43-51
Compost soppressiveness
Direct antifungal activity
Portici, 15 giugno 2018