Date post: | 21-Oct-2018 |
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Coltivazione dei batteriIdentificazione dei microrganismi
G I O VA N N I D I B O N AV E N T U R A
C I « M I C R O B I O L O G I A E M I C R O B I O L O G I A C L I N I C A »
C D S M E D I C I N A E C H I R U R G I A
U N I V E R S I TÀ “ G . D ’A N N U N Z I O ”, C H I E T I - P E S C A R A
A A 2 0 1 5 - 2 0 1 6
Terreni di colturaTerreno di coltura: mezzo nel quale o sul quale può avvenire lo sviluppo e la crescita in vitro di un microrganismo
Caratteristiche:
concentrazione adatta di nutrienti per la crescita batterica
adeguato grado di umidità
reazione (pH) adatta
sterili e protetti da qualsiasi inquinamento
Terreni di colturaContenuto qualitativo
Peptoni: insieme di composti idrosolubili, ottenuti per idrolisi (acida od enzimatica) delle proteine (caseina, soja, ecc.)
NaCl: aggiunto in concentrazioni adeguate per le necessità osmotiche richieste, in vivo, da alcuni microrganismi parassiti
Zuccheri: glucosio, lattosio, mannite, aggiunti per scopi specifici in terreni particolari
Estratti di lievito, carne, d’organo: forniscono fattori di crescita e sali inorganici
Arricchimenti: sangue lisato, emoglobina, latte disidratato, gelatina vitamine; necessari per la crescita di batteri più “esigenti” dal punto di vista nutrizionale
Supplementi selettivi: specifici (antibiotici) od a spettro meno definito (sali biliari, cristalvioletto, sodio-azide)
Indicatori: coloranti (fenolo, blu di bromo fenolo, rosso fenolo, verde di bromo cresolo, ecc.); a valori critici di pH del terreno ne causano il viraggio, fornendo in tal modo informazioni sul metabolismo fermentativo del batterio
Terreni di colturaClassificazione
In base allo stato fisico:
Terreni LIQUIDI (brodi): componenti sciolti in acqua e sterilizzati.
Terreni SOLIDI: possono essere naturalmente tali (terreno alla patata) o vengono solidificati per aggiunta di un agente gelificante (agar, gelatina, silica-gel)
In base alla composizione chimica:
Terreni MINIMI: per la crescita dei soli batteri autotrofi. Gli elementi essenziali (N, C, S, P) sono presenti come sali inorganici in composizione e quantità note.
Terreni SINTETICI (o Definiti): nota la formulazione chimica di ogni ingrediente; le singole sostanze di cui il batterio necessita sono presenti in quantità note.
Terreni COMPLESSI: non è nota l’esatta composizione chimica. Comprendono la maggior parte dei terreni usati in laboratorio (estratto di carne di bue, cuore, cervello, ecc.).
Terreni di colturaClassificazione
In base alla funzione:
Terreni di ARRICCHIMENTO (o ELETTIVI): la specie microbica di interesse vi cresce in un tempo assai più breve rispetto ad altre specie microbiche.
Terreni SELETTIVI: contengono sostanze batteriostatiche (sali biliari, tellurito di K, NaCl, azide sodica, cetrimide, cristalvioletto, antibiotici) a concentrazione nota che inibiscono o rallentano lo sviluppo di molte specie microbiche, ma non di altre. Utilizzati per l’isolamento di specifici microrganismi da campioni altamente contaminati.
Terreni DIFFERENZIALI: contengono sostanze indicatrici di particolari reazioni biochimiche che avvengono nel terreno stesso. Usati per la ID di specifici microrganismi.
Terreni di colturaPreparazione
1. Pesata degli ingredienti
2. Dissoluzione degli ingredienti
3. Correzione del pH al valore desiderato
4. Distribuzione nei recipienti (terreni liquidi)
5. Sterilizzazione terreni (calore umido: agar e brodi; filtrazione: brodi)
6. Distribuzione in capsule di Petri (terreni solidi)
7. Controllo della sterilità dei terreni
Terreni di colturaTecniche di semina
Semina per isolamento
Tecnica più frequentemente utilizzata per ottenere la crescita di colonie separate.
Lo striscio avviene mediante utilizzo di un'ansa sterile (bisogna evitare contaminazioni crociate con altri microrganismi presenti sulla superficie di tale oggetto).
Prevede una serie di semine in differenti aree della superficie dell’agar, in modo da disperdere le varie cellule presenti sull'ansa (prelevate da brodocoltura o da altra crescita su agar).
Terreni di colturaTecniche di semina
Semina per inclusione
Agevola la conta delle colonie batteriche.
La sospensione batterica viene miscelata, in capsula/piastra Petri sterile, al terreno agarizzato allo stato liquido (che, raffreddandosi, successivamente gelificherà). Mixare mediante movimenti orari, antiorari e a croce.
Solitamente, l’agar si cimenta con differenti diluizioni, in soluzione fisiologica (NaCl 0.9%) sterile, del campione.
Terreni di colturaTecniche di semina
Semina per infissione
Mediante un ago da inoculo, il campione viene seminato nello spessore del terreno agarizzato.
Consente di valutare il rapporto del metabolismo batterico con O2 sulla base della altezza in cui si osserva crescita: nella parte alta (AEROBIO), sul fondo (ANAEROBIO), diffusa (ANAEROBIO FACOLTATIVO)
Consente di valutare la motilità del microrganismo: se la crescita è diffusa, il batterio possiede flagelli.
Consente di valutare specifiche attività enzimatiche: proteasi, ureasi, produzione indolo
Terreni di colturaUtilizzo in Microbiologia diagnostica
Cetrimide Agar
Selettivo per l’isolamento e l’identificazione presuntiva di Pseudomonasaeruginosa. Magnesio cloruro e potassio solfato stimolano la produzione di pigmento. Cetrimide – composto ammonio quaternario verso cui P. aeruginosa è resistente - inibisce la crescita di gran parte dei microrganismi.
Columbia Blood Agar Base
Di uso generale, oppure quale base per terreni addizionati di sangue (S. aureus, streptococchi emolitici) e selettivi (cocchi Gram+, H. pylori, Gardnerella).
Hektoen Enteric Agar
Differenziale e selettivo per Salmonella e Shigella dalle altre Enterobacteriaceaein campioni enterici. I sali biliari inibiscono la crescita della normale flora Gram+. Presenza di tiosolfato (fonte di S) e sali di ferro (citrato ammonio ferrico) per evidenziare la produzione di H2S (colonie nerastre, Salmonella)
Terreni di colturaUtilizzo in Microbiologia diagnostica
Columbia blood agar base (Streptococcus poyogenes)
Cetrimide agar (Pseudomonas aeruginosa)
Hek
toen
ente
ric
agar
Terreni di colturaUtilizzo in Microbiologia diagnostica
MacConkey agar
isolamento e conta dei coliformi e degli Enterobatteri (Escherichia coli, Klebsiella spp, Salmonella spp, Shigella spp). Cristalvioletto e sali biliari inibiscono la crescita di Gram+. Il lattosio evidenzia la capacità fermentante: colonie fermentanti lac+ (Klebsiella, E. coli, Enterobacter aerogenes) appaiono di rosa acceso, incolori quelle non fermentanti lac- (Salmonella, Shigella, Proteus, Serratia, P. aeruginosa).
Wilkins-Chalgren Anaerobe Agar
non selettivo, per la crescita e tests di sensibilità degli anaerobi.
Urea broth base (terreno di Christensen)
evidenziazione attività ureasica delle Enterobacteriaceae mediante il viraggio di un indicatore di pH (rosso fenolo).
Terreni di colturaUtilizzo in Microbiologia diagnostica
MacConkey agar (lac+ vs lac-)
Urea broth base(Helicobacter pylori)
Wilkins-Chalgren Anaerobe Agar(Bacteroides fragilis)
Terreni di colturaUtilizzo in Microbiologia diagnostica
Mannitol Salt Agar
selettivo e differenziale per stafilococchi; elevata [NaCl] inibisce crescita di altri batteri; sistema fermentante: mannitolo e rosso fenolo; S. aureus, fermentante, produce colonie con alone giallo-brillante, mentre stafilococchi coagulasi-negativi (es. S. epidermidis), non fermentanti, formano colonie rosso porpora
Salmonella-Shigella Agar (SS Agar)
selettivo e differenziale per Salmonella e Shigella; sodio citrato, sali biliari e verde brillante inibiscono la crescita di Gram+ e alcuni enterobatteri; sistema fermentante: lattosio e rosso neutro; Proteus e Salmonella presentano colonie con centro nero, dovuto alla precipitazione del ferro solfuro, indotta dalla produzione di H2S a partire da sodio tiosolfato presente nel terreno
Saboraud Dextrose Agar
terreno acidificato per l’isolamento di diversi funghi e lieviti: Candida albicans(colonie incolori/rosa), Candida non-albicans (colonie rosa scuro/rosse)
Terreni di colturaUtilizzo in Microbiologia diagnostica
Agar sale-mannite Saboraud Dextrose agar(Candida albicans)
Agar Salmonella-Shigella(colonie nere di Salmonella, incolori quelle di Shigella)
Terreni «dedicati»Isolamento di agenti eziologici poco frequenti
Campione Diagnosi presuntiva Batteri patogeni Terreni per l'isolamento
Feci Colera Vibrio choleraeVibrio parahaemolyticus
Acqua peptonata alcalina
Faringe Infiammazione ostruttiva epiglottide e faringe
Faringite membranosa
Haemophilus influenzae
Corynebacterium diphteriae
Agar sangue cioccolatoAgar Casman
Agar LoefflerAgar TinsdaleTerreno al tellurito di sodio
Tampone rinofaringeo
Pertosse Bordetella pertussis Bordet-Gengou
Escreato Tubercolosi
Micosi polmonare
Mycobacterium tuberculosis
Blastomyces dermatitidis
Lowenstein-JensenMiddlebrook 7H-11
Brain-heart Infusion agarUrina Leptospirosi Leptospira spp. Semisolido di Fletcher
Sangue, midollo osseo o biopsia
Brucellosi Brucella spp. Agar brucella
Terreni «dedicati»Isolamento di anaerobi ed «esigenti»
Terreno Scopo
Agar sangue Terreno in piastra non selettivo di uso generale
Agar cioccolato Utilizzato principalmente per l'isolamento di Haemophilus e Neisseria; usato anche per l'isolamento di anaerobi esigenti
Agar MacConkey Isolamento di bacilli Gram- aerobi ed anaerobi facoltativi
Agar sangue feniletil alcool Isolamento cocchi Gram+ anerobi facoltativi ed anaerobi obbligati Gram+ e Gram-
Terreno al tioglicolato + emina + vitamina K1
Brodo di arricchimento utilizzato per arricchire i terreni in piastra particolarmente se il campione è scarso
Terreno di Thayer-Martin modificato Impiegato per arricchire i terreni per anaerobi quando si sopetta nel campione la presenza di Neisseria gonorrhoeae o N. meningitidis
Agar sangue kanamicina-vancomicina Isolamento selettivo di bacilli anaerobi Gram-
Crescita battericaDefinizioni
Crescita vs Tolleranza
la crescita presuppone attiva divisione cellulare (riproduzione) e, quindi, aumento di biomassa; si usa il suffisso “-fili”
in condizioni non permissive per la crescita, alcuni microrganismi possonosopravvivere ma non riprodursi, si usa il suffisso “-tollerante”
Esempio:
- un batterio “termofilo” cresce in presenza di elevate temperature
- un batterio “termotollerante” sopravvive ad elevate temperature, ma cresce a temperature inferiori
Obbligato (stretto) vs facoltativo
“Obbligato” (o “stretto”): una data condizione è necessaria per la crescita
“Facoltativo”: il microrganismo può crescere in quella condizione, sebbene non necessaria; viene spesso usato in presenza di condizioni sub-ottimali.
Esempio:
- un “termofilo obbligato” necessita di elevate temperature per la sua crescita
- un “termofilo facoltativo” può crescere sia ad alte che basse temperature
Crescita battericaRegolazione: temperatura
La maggior parte dei batteri cresce in un intervallo termico di circa 20°C, esibendo la massima velocità di crescita ad un certo “optimum termico”
Psicrofili: crescono nel range 0 – 20 °C (Listeria monocitogenes; Flavobacterium)
Mesofili: crescono nel range 10 – 50 °C (maggior parte; E. coli)
Termofili: crescono nel range 40 – 75 °C (Bacillus stearotermophilus)
Ipertermofili: crescono nel range 70 – 110 °C (Pyrodictium brockii)
Crescita battericaRegolazione: pH
La maggior parte dei batteri cresce a valori di pH compresi tra 6 ed 8, esibendo la massima velocità di crescita ad un certo “optimum di pH”
Acidofili: crescono al di sotto di pH 6 (pH 2-6, generalmente); funghi e lieviti generalmente più tolleranti vs batteri (pH 5-6)
Neutrofili: crescono a pH 6-8; la maggior parte dei batteri
Alcalofili: crescono a pH > 8 (pH 8-9.5, generalmente)
Crescita battericaRegolazione: pressione osmotica
Crescita battericaRegolazione: alofilia
Alofili:
crescono ad elevate concentrazioni saline (generalmente 1 M), sopportando elevate pressioni osmotiche e bassa aw;
microrganismi alotolleranti (1-6% NaCl), alofili (6-15% NaCl), alofili estremi (15-30% NaCl)
queste condizioni sono incompatibili con la vita di gran parte deimicrorganismi
Crescita battericaRegolazione: O2
Aerobi obbligati: crescono soltanto in presenza di O2
Aerobi facoltativi: crescono meglio in presenza di O2, ma anche in assenza
Anaerobi obbligati: crescono in assenza di O2
Anaerobi facoltativi: crescono meglio in assenza di O2, ma anche in presenza
Microaerofili: crescono in presenza di (O2 5%, CO2 10%, N2 85%)
Giara per anaerobiosi
Figure 6.5
Cappa (camera) per anaerobiosi
Crescita battericaAtmosfera «controllata»: anaerobiosi
Carbossifilia (5% O2, 10% CO2, 85% N2)
Giara con “candela”
Sistemi per generazione di carbossifilia
Crescita battericaAtmosfera «controllata»: carbossifilia
Identificazione dei microrganismi1. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione)
Colorazione di Gram
Colorazione di Ziehl-Neelsen
2. Caratteristiche macroscopiche (colturali) tipo (aspetto) coloniale
emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilità), etc.
crescita su terreni selettivi
3. Caratteristiche biochimiche
4. Caratteristiche antigeniche (ID sierologica)
5. Tipizzazione fagica
6. Identificazione genotipica
ID dei microrganismi Aspetto macroscopico delle colonie
Rilievo
Forma
Superficie
Margine
ID dei microrganismiAspetti macroscopici (emolisi)
Staphylococcus aureusStreptococcus pyogenes
Emolisi completa (β-emolisi)
ID dei microrganismiAspetti macroscopici (fermentazione)
Agar sale mannite.
A) Il mannitolo non viene fermentato (S. epidermidis); il terreno non vira.
B) Fermentazione del mannitolo ad opera di S. aureus; il terreno vira al giallo.
A B
ID dei microrganismiAspetti macroscopici (sciamaggio)
Proteus mirabilis.
Il batterio si muove grazie ai numerosi flagelli disposti alla superficie cellulare (peritrico), formando «fronti» concentrici (sciamaggio).
ID dei microrganismiCaratteristiche biochimiche
Enterobacteriaceae, in particolare:
capacità di utilizzare determinati substrati come unica fonte di carbonio
• acidi organici o loro sali (acetato, citrato, malonato) + indicatore pH (blu di bromotimolo: vira al blu a pH basico)
presenza di particolari enzimi
• ureasi, lisina- ornitina-decarbossilasi, arginina-diidrolasi, beta-galattosidasi, ureasi
produzione di specifici prodotti metabolici terminali
• H2S, indolo, acetoino (reazione di Voges-Proskauer)
capacità di fermentare particolari zuccheri (O-F test)
• 1% carboidrato + indicatore pH + campanella di Durhan (produzione di gas)
API (bioMérieux) Identification System
ID dei microrganismiCaratteristiche biochimiche
ID dei microrganismiCaratteristiche antigeniche
La ricerca di Ag specifici avviene mediante utilizzo di Ab specifici.
Utilizzo di antisieri (Ab specifici) per reazione di agglutinazione
colonia stemperata in NaCl + antisiero specifico
reazione positiva: agglutinazione dei microrganismi
Utilizzo di sferule di latex quali «carrier» di Ag o Ab (reazione macroscopica di agglutinazione)
Possibile tipizzazione specifica ed intra-specifica (tipi sierologici o sierotipi)
Agglutinazione
Ab
Ag
latex bead
ID dei microrganismiTipizzazione fagica
Nell’ambito di una stessa specie possiamo rinvenire differenti ceppi batterici (sottospecie o tipi), ciascuno dei quali caratterizzato da un peculiare grado di virulenza.
E’ possibile utilizzare la tecnica della tipizzazione fagica a fini identificativi e/o epidemiologici (studio delle modalità di diffusione dell’infezione).
Questo è il caso di S. aureus:
estremamente sensibile a numerosi (20) virus batterici (batteriofagi o fagi) virulenti (litici)
sensibilità non uniforme (ceppo-specifica)
individuazione di “tipi fagici”
ID dei microrganismiTipizzazione fagica
ID dei microrganismiIdentificazione molecolare
Polymerase Chain Reaction (PCR)
amplificazione di sequenze “bersaglio”, specifiche per il genere, la specie o lo stipite batterico
elevata sensibilità (necessarie poche copie del target di partenza) e specificità
sequenziamento genico (genotipizzazione)
RNA ribosomale
grandi quantità di rRNA altamente conservate in specie differenti
presenza di sequenze di rRNA “specifiche” per specie e tipo. Il grado di differenza nell’rRNA di due batteri è funzione diretta della «vicinanza» filogenetica: piccole differenze sono suggestive per una “vicinanza” tra le specie, mentre grandi differenze indicano una distanza maggiore
l’individuazione di un pattern in rRNA che non trovi riscontro in nessuna altra sequenza nota, indica la scoperta di una nuova specie.
ID dei microrganismiIdentificazione molecolare