Come una variazione locale di attività enzimatica influisce sul sistema?

Aumentiamo un poco E2. Cosa succederà a monte di E2?

S1 scende, ma questo comporta:

una diminuzione di v2 e un aumento di v1

13210 XSSSX 4321 E E E E

v1 v2 v3 v4

Non è possibile prevedere intuitivamente la risposta del sistema (il nuovo ss) a motivo degli effetti incrociati.

Esistono però dei vincoli tra le proprietà sistemiche (es. i CJ) in termini delle elasticità che possiamo derivare. Come?

Similmente S2 sale e questo comporta:

una diminuzione di v2 e un aumento di v3

4321 e e e e13210 XSSSX

4321 E E E E

v1 v2 v3 v4

Coefficienti di risposta

How can we describe the sensitivity of a steady-state variable to a perturbation of the local rate (activity) through a specific step caused by a change in a parameter that affects this step directly?

Cambio il parametro x raggiungo un nuovo steady state

il flusso passerà da J a J + δJ

Although the parameter acted locally on step i, the change we observe is systemic in the sense that the properties of all steps in the system contributed to the observed change in the steady state.

Coefficiente di rispostaSupponiamo che un enzima in una via metabolica sia sensibile ad un inibitore I. Quale sarà il cambiamento del flusso nella via quando aggiungo l’inibitore in vivo? Dipenderà da a) quanto è forte l’effetto dell’inibitore sull’enzima

IdIv

dv

E

I

b) quanto è forte il controllo del flusso da parte dell’enzima (quanto vale il suo CJ)

k

k

E

I

J

E

k

k

εlnI

lnv

lnv

lnJ

lnI

lnJCR J

I

Posso descrivere l’effetto di un qualsiasi composto attraverso l’elasticità degli enzimi sensibili a quel composto e i corrispondenti CJ

Come riformulare quantitativamente l’analisi di una

via metabolica?Flusso nella via: J

X0 S1 S2 S3 ….. X1

E1 E2 E3 E4 … En

v1 v2 v3 v4 … vn

Variabili: il flusso J, n metaboliti e (n+1) enzimi

Possiamo ricavare il valore dei coefficienti di controllo (CJ e CS)?

Quante incognite e quante equazioni?La via metabolica prevede:

Il flusso, n metaboliti e (n+1) enzimi, le cui sono note (o conoscibili tramite esperimento)

Come incognite ci sono:

(n+1) CJ e n(n+1) CS cioè n+1 + n(n+1) = (n+1)2

Per ricavare il valore numerico dei coefficienti abbiamo bisogno di avere (n+1)2 relazioni tra i coefficienti

Sappiamo che esiste 1 equazione che lega i CJ e n che legano i CS

Mancano n2 + n equazioni che ricaviamo dai teoremi della connettività

E’ possibile ottenere una piccola variazione nella concentrazione di un metabolita interno al sistema (es. δS2), senza cambiare il flusso J o le concentrazioni degli altri metaboliti (es. S1)?

J

J

i

i

S

dSi

J

i

i

v

S

i

iv

Eε

E

dEε

v

dv

RISPOSTA: è possibile se oltre al metabolita simultaneamente cambia anche qualche altro parametro (ad es. se l’enzima Ei aumenta della quantità dEi), in modo da mantenere costante la velocità vi dell’enzima in questione; la variazione di velocità sarà nulla e i due cambiamenti saranno legati come segue:

0

Connettività per i metaboliti (CJ)

0S

δSε

e

δeε

v

δv

2

2v

S

1

1v

e

1

1 1

2

1

1 Per la reazione 1

Per le reazioni 2 e 3

Normalmente questa ε vale 1 perchè la velocità di un enzima isolato aumenta dell’1% se metto l’1% in più di enzima

La reazione 1 è influenzata non solo da S1 ma anche da S2

Che δe1 abbia un effetto compensativo dell’effetto di δs2 on v1:

Although the system is in a new steady state (some parameters have changed), only the value of S2 is different; J and S1 are still the same.

S1 non ha alcun effetto diretto sulla velocità di E3, per cui il termine sarà nullo e l’espressione è più semplice3

1

v

Sε

0εCεC 2

1

1

1

vS

JE2

vS

JE1

Teorema della Connettività (CJ) per il metabolita S2

S2 ha un effetto diretto sulla velocità di E1 per cui 0ε 1

2

vS

Facendo lo stesso per S1

Per ogni metabolita posso scrivere una relazione tra i CJ in base al teorema della connettività

n equazioni della connettività (CJ) (una per ogni metabolita) (a cui si aggiunge 1 teorema della somma per i CJ)

sono sufficienti per risolvere il sistema di equazioni che coinvolgono i CJ.

In totale abbiamo quindi (n+1) relazioni che legano i CJ

Combining the summation theorems with the connectivity theorem, we are able to express the flux control coefficients in terms of the elasticities of the enzymes towards the internal metabolite concentrations.

n2 equazioni della connettività (CS) (n per ogni metabolita) (a cui si aggiunge n teoremi della somma per i CS)

sono sufficienti per risolvere il sistema di equazioni che coinvolgono i CS

Per mezzo di ragionamenti analoghi è possibile derivare le relazioni tra i CS e le ε

1i

ES

S

Ei

j

j

iC

01

n

i

ES

SEkh

i

k

h

iC

Teorema della connettività per i CS con εS

e CS definiti per lo stesso metabolita S (Sj).

Teorema della connettività per i CS con εS

e CS definiti per metaboliti diversi

Connettività per i CS

Es., per S2 nello schema della diap. 6

Es., per S2 nello schema della diap. 6

Sistemi semplici

110 XSX 21 E E

121 J

EJE CC 02

12

1

11 E

SJE

ES

JE CC

E’ un sistema di due equazioni in due incognite

1

1

2

1

1

1

1 ES

ES

ESJ

EC

1

1

2

1

2

1

2 ES

ES

ESJ

EC

Somma CJ connettività CJ

01

1 E

S

01

2

1

1 S

ESE CC

Se considero anche i CS avrò ancora due equazioni in due incognite

12

1

1

2

1

1

1

1 E

SSE

ES

SE CC

Essendoci 1 solo metabolita interno (S1) non esistono altre relazioni della connettività dei CS

Anche i CS possono essere definiti sulla base delle elasticità

1

1

2

1

1

1

1ES

ES

SEC

1

1

2

1

1

2

1ES

ES

SEC

Control coefficients in a three-step pathway(http://bip.cnrs-mrs.fr/bip10/mca6.htm#2)

1

1

2

2

3

2

2

1

3

2

1

1

3

2

1

1

2 ES

ES

ES

ES

ES

ES

ES

ESJ

EC

321 e e e

v1 v2 v3

1210 XSSX

1

2

2

1

2

2

1

1

3

2

1

1

3

1

2

1

2

2

3

21

1 ES

ES

ES

ES

ES

ES

ES

ES

ES

ESS

EC

Esempi dei valori di un CJ e di un CS

Posso risolvere il sistema!!!

Esempi più complessi ma ancora semplici da risolvere manualmente: vedi via metabolica descritta in

Cap. 10 di “Fundamentals of Enzyme kinetics”,  di A. Cornish Bowden

Vai a: Go to chapter 10 “Fundamentals of enzyme kinetics )

Per sistemi complessi (con tanti enzimi, biforcazioni e substrate cycles), ci vuole l’algebra matriciale

(vedere su questo Hofmeyr-Westerhof-Snoep, cap.2)

…e se conosco le leggi cinetiche per gli enzimi e la concentrazione di S1, allora posso ricavare il valore numerico delle elasticità e quindi il valore dei CJ e dei CS

I coefficienti (del flusso e delle concentrazioni) dipendono anche dai valori dei parametri (X0, X1, quantità dei vari enzimi…). Se cambiano i parametri, automaticamente cambia lo ss e i valori

* delle concentrazioni dei metaboliti

* del flusso

Cosa serve un modello?

Nei modelli dinamici come quelli appena descritti, ricavo i valori di CJ che suggeriscono i punti di intervento (metabolic engineering). Non è garantito il successo (il modello potrebbe essere sbagliato!) ma almeno posso fare predizioni da mettere alla prova …

Una raccomandazione:

Abbiamo introdotto i concetti di Coefficiente di controllo 1) del flusso e 2) delle concentrazioni)

Non torniamo indietro ad usare la vecchia nomenclatura del Rate Limiting Step!

Alla domanda “How much?” (quanto un enzima influenza un flusso o una concentrazione) rispondiamo con un valore numerico (CJ o CS ).

ReferenzePer il concetto di CJ e di elasticità, vedi

* Fell “understanding the control of Metabolism”, 1997 cap. 5;

Vedi anche il cap. 10 di “Fundamentals of Enzyme kinetics”,  di A. Cornish Bowden

Go to chapter 10 “Fundamentals of enzyme kinetics” (http://bip.cnrs-mrs.fr/bip10/mca0.htm)

Per la dimostrazione dei teoremi si veda anche la ristampa dell’articolo originale:

* Kacser, Burns, Fell (1995) The control of flux. Biochem. Soc. Trans. 23, 341-366

* Jan-Hendrik S. Hofmeyr, Jacky L. Snoep, Hans V. Westerhoff Kinetics, Control and Regulation of Metabolic Systems, Pag. 66-75 (chapter 3: Metabolic Control Analysis)

Tesi Teusink: http://www.narcis.nl/publication/RecordID/oai%3Auva.nl%3A79049

Da leggere: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9202124

Possiamo così calcolarci per ogni enzima che sia sensibile a sJ, quale debba essere il corrispondente cambiamento di concentrazione in Ei (dEi) per ottenere una vi costante (ammettiamo per semplicità che SJ influisca solo sulla velocità degli enzimi E2 ed E3.

03

3

2

2

J

dJ

S

dSC

S

dSC

J

JE

S

J

E

J

JE

S

J

E JJ

0i

E

S

J

Ei

JiC 0

iJ

JE

S

J

E S

dSC i

Ji

J

J

S

dSi

J

v

S

i

i εE

dE

Per una variazione in dSJ a flusso costante, possiamo riscrivere il teorema della somma*:

Più in generale

Formulazione alternativa del teorema della connettività per i CJ

S2 affects the activities of the enzymes in the pathway (described by the elasticities), and these affect the flux (via the flux control coefficients). In the end, however, the total response of the system to a change in the concentration of S2 should be zero