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Biotecnologie Agro-‐Industriali. Biologia Cellulare. M.E. Miranda Banos

Dal RNA alle proteine: la traduzione

Replicazione del DNA Riparazione del DNA

Ricombinazione gene4ca

Sintesi del RNA Trascrizione

Sintesi delle proteine Traduzione

TRADUZIONE: SINTESI DI PROTEINE

Trascrizione: copiare un messaggio usando lo steso linguaggio (o quasi).

Traduzione: copiare un messaggio usando un linguaggio diverso: Il codice gene4co



Il codice geneHco è faKo di parole di tre leKere (basi): codoni

4 nucleoHdi in gruppi di 3: 4 x 4 x 4 = 64 parole 20 aminoacidi

Questo codice è quasi universale, a eccezione di alcune differenze in mitocondri e alcuni protozoi e funghi.



Come è stato decifrato il codice geneHco? Primi anni sessanta. -‐  Prima di tuKo, si è creato un sistema acellulare (cell free system) per studiare la sintesi di proteine in assenza di tuY gli altri componenH cellulari. Come? Prendendo i componenH del citoplasma di E. coli e centrifugando ad alta velocità per tenere solo la parte solubile: ribosomi e molecole; gli mRNA baKerici si distruggono con una ribonucleasi. -‐  Secondo, si sono creaH polinucleoHdi faY di solo U (e poi solo A e solo C), e si sono aggiunH al sistema acellulare, insieme ad amminoacidi radioaYvi isolaH, uno per esperimento. Così si sono capiH tre codoni: UUU (fenilalanina), AAA (lisina) e CCC (prolina). -‐  Terzo, si sono creaH tripleKe di nucleoHdi, e usandoli uno a uno insieme a ribosomi e amminoacidi isolaH, si è capito tuKo il codice geneHco.



Un polinucleoHde si può leggere in tre maniere, a seconda se si comincia dal primo, dal secondo o dal terzo nucleoHdi a fare i codoni, ma in ogni mRNA c’e soltanto un messaggio correKo che produce una proteina funzionale: c’e un solo modulo di le;ura correKo (reading frame).



Gli RNA transfer (tRNA): adaKatori per appaiare ogni codone al suo amminoacido. Lungi ˜80 nucleoHdi, un stremo lega il codone appaiando tre nucleoHdi: l’an4codone. L’altro stremo (3’) lega il amminoacido codificato dal anHcodone.



64 codoni

˜40 tRNA

20 amminoacidi

Ci sono più tRNA di 20: -‐  Alcuni amminoacidi legano più di un Hpo di tRNA (anHcodoni diversi ma ‘sinonimi’). -‐  Alcuni tRNA legano più di un codone, legando più specificamente i primi due nucleoHdi ma essendo meno esigenH per il terzo nucleoHde (appaiamento oscillante).

Esempio: arginina: AGA, AGG, CGA, CGC, CGG, CGU



Il secondo adaKatore per decifrare il codice geneHco: le amminoacil-‐tRNA sintetasi. Sono gli enzimi che legano il giusto amminoacido al corrispondente tRNA (o tRNAs). Sono in grado di riconoscere sia delle sequenze nei tRNA che la struKura del amminoacido a legare, e usano energia (ATP) per catalizzare la formazione di un legame ad alta energia.

tRNA sintetasi

Legame ad alta energia





Già ne abbiamo il messaggero e i tRNA pronH, ora ci manca la macchina molecolare per meKerli insieme: i ribosomi.



I ribosomi sono faY di proteina (proteine ribosomiche) e rRNA (RNA ribosomico), che si trascrive nei nucleoli, dove si assemblano le subunità ribosomiche: -‐  Subunità maggiore -‐  Subunità minore Subunità maggiore Subunità minore





Le due subunità si legano fra di loro aKorno a un mRNA, e si slegano alla fine della traduzione. Nel ribosoma ci sono un sito di legame per il mRNA e tre siH per i tRNA.

Sito A: amminoacil-‐tRNA Sito P: pep4dil-‐tRNA Sito E: exit (uscita)



LA SINTESI DELLE PROTEINE Comincia dall’estremità 5’ del mRNA. Le due subunità si legano al mRNA e cominciano la sintesi. I siH A, P ed E si occupano due alla volta. Arriva un tRNA-‐aa nuovo (4) che si appaia al codone nel sito A, subito dopo il codone precedente.



Messi uno accanto all’altro, gli aa ai posH P e A vengono legaH in maniera covalente (legame pepHdico), grazie all’azione enzimaHca della subunità maggiore del ribosoma e alla energia liberata dal legame fra tRNA e amminoacido (3).

In questa configurazione, l’estremità carbossilica del amminoacido in P si lega alla’estremità amminica del amminoacido in A: la proteina si sinteHzza dall’estremità ammino a quello carbossile.



Dopo la formazione del legame pepHdico, la subunità maggiore si sposta verso l’estremità 3’ del mRNA. Il tRNA dove l’ulHmo amminoacido è stato incorporato e legato al polipepHde in crescita si sposta dal sito A al sito P, e il tRNA vuoto dal sito P al sito E.



La subunità minore si sposta a seguito di quella maggiore, rendendo accessibile il sito A al prossimo tRNA-‐aa in arrivo.



Col arrivo de un nuovo tRNA che entra nel sito A si ricomincia il ciclo da capo.

I ribosomi degli eucarioH fanno questo ciclo due volte al secondo: allungano la catena polipepHdica di due amminoacidi al secondo. Quelli dei procarioH vanno anche più velocemente.

Queste reazioni sono aiutate da faKori proteici: fa;ori d’iniziazione, allungamento e terminazione .







Il ribosoma è faKo 1/3 di proteina e 2/3 di RNA, ed è il rRNA ad avere un ruolo centrale nella struKura e nella funzione del ribosoma: è un ribozima. Gli rRNA formano il cuore del ribosoma, le proteine si legano sulla superficie, stabilizzando gli rRNA e aiutando nei cambiamenH conformazionali necessari per la sua aYvità cataliHca.

I siH A, P ed E e il sito cataliHco sono faY da rRNA. Nel sito cataliHco, le interazioni fra i rRNA e i tRNA avvicinano e orientano i due amminoacidi che si devono unire per legame pepHdico, per procedere alla catalisi di questo legame.

StruKura di due dei rRNA e una proteina della subunità maggiore

ribosomiale







In più deKaglio: l’inizio della traduzione nei eucarioH.

TuKe le proteine cominciano da un codone d’inizio: AUG, al quale corrisponde il amminoacido Met. Il primo tRNA-‐Met è il tRNA iniziatore, diverso d’altri tRNA-‐Met, il unico in grado di legarsi alla subunità minore: -‐ prima si legano i fa;ori d’inizio della traduzione, -‐ dopo si lega il tRNA iniziatore, -‐ e finalmente tuKo il complesso si lega all’estremità 5’ (riconosciuto dal cappuccio) di un mRNA per iniziare la traduzione.



Una volta legata al mRNA, la subunità minore si muove verso l’estremità 3’ in ricerca del primo AUG dove cominciare la traduzione.

Quando lo trova, i faKori d’inizio si slegano e si unisce la subunità maggiore, completando il ribosoma.

Col arrivo del secondo tRNA-‐aa comincia la traduzione.



Nei baKeri i messaggeri non hanno un cappuccio 5’. In vece ci sono delle sequenze nucleoHdiche a monte del AUG che indicano l’inizio di ogni gene, e dove i ribosomi si legano. I messaggeri dei baKeri sono policistronici: ci sono diversi geni in ogni messaggero, ognuno con la sua sequenza d’inizio. Così la traduzione di ogni gene al interno del messaggero può cominciare indipendentemente degli altri.



Sia nei procarioH che nei eucarioH l’arrivo a un codone di terminazione (UAA, UAG, UGA) segnala la fine del messaggio. Non ci sono tRNA per legare quesH codoni.

In vece si legano i fa;ori di rilascio, che modificano la procedura in modo di legare una molecola di acqua all’estremità C-‐terminale della proteina, che è finita.

La proteina si stacca dal ribosoma, il ribosoma si separa dal mRNA e le subunità si staccano.



A un solo messaggero si aKaccano diversi ribosomi, partendo dal codone d’inizio e man mano che il ribosoma precedente avanza lungo il messaggero. Così si formano i poliribosomi, che sinteHzzano tante coppie della proteina simultaneamente.





I ribosomi baKerici e quelli eucariHci hanno piccole differenze. Queste sono state sfruKate dai funghi per creare delle tossine in grado d’inibire la sintesi di proteine baKeriche: molH degli anHbioHci.

Tetraciclina

Streptomicina

Cloramfenicolo

Cicloesimide

Rifamicina

Ostacola il legame del amminoacil-‐tRNA al sito A del ribosoma ba;erico

Impedisce il passaggio del ribosoma dalla modalità d’inizio a quella d’allungamento; induce pure errori di codifica

Blocca la reazione della pep4dil-‐trasferasi sui ribosomi

Blocca la reazione di traslocazione sui ribosomi

Blocca l’inizio della sintesi di RNA legando la RNA polimerasi



Quante copie di una proteina ci sono nella cellula dipende:

-‐della quanHtà che si sinteHzza

-‐di quanta proteina si distrugge



Meccanismi di regolazione della traduzione.

-‐  1. Repressione della traduzione mediata da proteine regolatrici che legano il mRNA nella regione 5’ non tradoKa.

-‐  2. Repressione della traduzione mediata da proteine che legano il mRNA nella regione 3’ non tradoKa. In alcuni casi lo fanno interagendo con i faKori d’iniziazione.

Le proteine che legano il 3’UTR possono pure localizzare gli mRNA in posH specifici al interno della cellula, e questo può essere molto importante funzionalmente (ad esempio durante lo sviluppo embrionale).

mRNA d’embrioni di Drosophila (blue) rilevaH per ibridazione in situ a fluorescenza (rosso: nuclei)



-‐ 3. Micro RNA (miRNA): piccoli RNA a doppio filamento che regolano sia la trascrizione che la traduzione, interagendo con complessi proteici diversi in ogni caso.

A livello del mRNA, i miRNA possono indurre la degradazione o soltanto inibire l’espressione, a seconda del mRNA bersaglio. Questo meccanismo è molto diffuso, e sembra importante come meccanismo veloce per regolare l’espressione genica.



-‐ 4. Controllo globale della traduzione proteica: -‐  Le cellule soKo stress possono ridurre la traduzione bloccando i faKori d’iniziazione della traduzione. -‐  Le cellule sHmolate dai faKori di crescita possono aumentare i livelli di traduzione.

Stress nutrizionale Stress del RER Stress ossidaHvo

FaKori di crescita



Il tempo fra sintesi e degradazione è la vita media della proteina.

La degradazione è a carico di proteasi, che tagliano i legami pepHdici fino a ridurre le proteine ad amminoacidi. Queste si trovano: -‐  Nei lisosomi. -‐  Nel citoplasma, come componenH dei proteosomi, macchine per la degradazione di proteine con un centro cilindrico dove le proteasi si trovano all’interno. Le proteine che devono essere degradate dai proteosomi sono marcate con la ubiqui4na.

Date post:	18-Feb-2019
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