Caserta 31 maggio 2008
Cristina MassaiClinica Pediatrica IIOspedale Meyer
Università di Firenze
Diagnosi e tipizzazione di IPD in biologia molecolare direttamente da campione clinico in pazienti con terapia antibiotica in atto
tempo dopo la somministrazione dell’antibiotico[ore]
tempo di sterilizzazione del liquor cefalo-rachidianodopo somministrazione di antibiotico per via parenterale
Kanegaye JT et al. Pediatrics 2001; 108: 1169-1174
2418126
coltura positiva coltura negativa
Neisseriameningitidis
Streptococcuspneumoniae
Streptococcusgruppo B
Dipartimento di PediatriaUniversità di Firenze
Coltura PCR
Richiede
non terapia antibiotica precedente
OK se terapia antibiotica precedente
germe vivo germe anche morto
terreni di coltura adeguati anche in fisiologicaanche campione “già usato”
trasporto rapido a t°C ambiente anche 48h
laboratorio microbiologia tecniche e macchinari semplici
Si estrae il DNA
Si parte da sangue intero
Primers per:
9V1423F
6B
Nucleotidi EnzimiDNA estratto
altri
Sierotipizzazione: PCR- Multiplex Sequenziale
Diagnosi e sierotipizzazione mediante PCR multiplex sequenziale di infezioni
pneumococciche in età pediatrica(BP + meningiti/sepsi)
RT-PCR n: 22/98Coltura n: 4/98
05
101520253035
%dicasi positivi
25/98hanno fattobreve terapia antibioticaprima del ricovero
0
5
10
15
20
25
30
35
40
RT-PCR n: 9/25Coltura n: 0/25
%di casipositivi
Paz. con pregressa Paz. con pregressa terapia terapia antibioticaantibiotica
Distribuzione dei sierotipi isolati in corso di malattie invasive del bambino
Sierotipo contenuto nel vaccino eptavalente
3
2
1
0
polmonite meningitesepsi
artrite
Esame colturaleEsame colturale
Azzari C, Moriondo M, Massai C, Resti M.J Med Microbiol 2008
Distribuzione dei sierotipi isolati in corso di malattie invasive del bambino
Sierotipo contenuto nel vaccino eptavalenteAzzari C, Moriondo M, Massai C, Resti M.J Med Microbiol 2008
3
2
1
0
polmonite meningitesepsi
artrite
6 8 19F 1 3 4 12 14 18 18C 19A ? ? 4 6 9V/A 23F 22F ?
Esame PCREsame PCR
Parliamo di costi……
Un apparecchio per real-time PCR
Un apparecchio per PCR standard
25.000 €
5.000 €
Un test di diagnosi
Un test di sierotipizzazione
5 €
12 €
La sola sierotipizzazione da coltura costa 45 €
(gli stessi che usiamo per HCV, HIV, CMV)
Progetto sorveglianza nazionale delle infezioni invasiveMeningococco, pneumococco, Haemophilus
Miglioramento della possibilità di diagnosi mediante biologia molecolare
Sensibilizzazione al problema
Centralizzazione presso l’Ospedale Meyer dei campioni per diagnosi
Diffusione delle metodiche diagnostiche molecolaria tutte le regioni
I fase
II fase
Progetto Malattie InvasiveLaboratorio Immunologia Meyer
Viale Pieraccini 2450139 FIRENZE
L’esecuzione del test è gratuita
La risposta viene inviata via FAX all’ospedale richiedente entro 48 ore dall’arrivo
Chiamare TRACO 10 - Tel. 803-868
La spedizione del campione ègratuita (a carico del destinatario) Indicare “PORTO ASSEGNATO”
Grazie per l’attenzione!!!!
IPD in bambini italiani valutata con colturaIPD in bambini italiani valutata con coltura
D’Ancona F. Vaccine 2005Italian PNC-Euro Working group
0
10
20
30
40
50
60X 100.000
piemontepuglia
116
< 2 anni
11,511,5
Azzari Resti 2007
Provincia di Firenze
Incidenza di infezioni invasive Incidenza di infezioni invasive pneumococcichepneumococciche (IPD)(IPD)valutata con PCR o mediante colturavalutata con PCR o mediante coltura
Casi x 100.000
Incidenza di IPDIncidenza di IPDnella popolazione pediatrica fiorentina nella popolazione pediatrica fiorentina
valutata mediante colturavalutata mediante coltura
0
10
20
30
40
50
60
anni<1
11,2
<2
11,5
<5
4,7
<14
3,6
Casi x 100.000
anni
Incidenza di IPDIncidenza di IPDnella popolazione pediatrica fiorentina nella popolazione pediatrica fiorentina
valutata mediante PCRvalutata mediante PCR
0
10
20
30
40
50
60
<1
55,8
<2
51,8
<5
35,1
<14
19,9
RT-PCR nella diagnosi di infezioni invasive da pneumococco
0
5
10
15
20
25
Broncopolmoniti n: 82Broncopolmoniti n: 82
positivi RT-PCR n: 18
positivi Coltura n: 2
%
0
20
40
60
80
100
positivi RT-PCR n: 11
positivi Coltura n: 5
Meningiti / sepsi n: 11Meningiti / sepsi n: 11PneumoPneumo--MeningoMeningo%
Progetto Malattie Invasive
Real-Time PCR per PNEUMOCOCCO: primer per gene PLY (pneumolisina) conferma primer cps-A (PCR in gel di agarosio)
4 campioni
Entitàdi fluorescenza
Cicli di amplificazionenel tempo
L’amplificazione di un prodotto significa presenza di DNA specificoSi evidenzia come incremento di fluorescenza
