Domande
• Come avviene la replicazione del DNA?• Quali enzimi sono necessari?• Quali sono le differenze fra procarioti ed Eucarioti?
La girasi di E.coli è una topoisomerasi di tipo II che usa l’idrolisi di ATPper fornire l’energia necessaria all’ introduzione di superavvolgimenti inuna molecola circolare chiusa rilassata
Si lega al DNA e lo superavvolge processivamente e catalitic amenteContinua ad introdurre superavvolgimenti nella stessa mol ecola di DNAPuò introdurre circa 100 superavvolgimenti al minut o
La DNA girasi di E.coli
Mechanismo di Azione
I chinoloni sono farmaci battericidi.
Inibiscono la DNA girasi batterica detta anche topoisomerasi IV inibendocosì la replicazione e la trascrizione del DNA batterico.
I chinoloni entrano nel batterio attraverso dei canali detti porine e perciòvengono usati nel trattare infezioni batteriche di patogeni che si replicano
all’interno di cellule umane quali la legionella ed il micoplasma pneumonie.
Per molti batteri gram negativi la DNA girasi è il target di questi antibattericimentre per molti gram positivi il target è la DNA topoisomerasi IV
Le cellule eucariotiche non contengono ne DNA girasi e ne DNA topoisomerasi IV
Spettro di azione dei chinolonici
1° GenerazioneAcido nalidissico: Escherichia coli, Proteus, Shigella, Enterobacter, e Klebsiella.
2° GenerazioneCiprofloxacina: Come quelli della prima generazione ed nei confronti della salmonella typhy
3° GenerazioneGatifloxacina: Chlamydophila pneumoniae e Mycoplasma pneumoniae
4° GenerazioneGemifloxacina: Moraxella catarrhalis, Acinetobacter lwoffii, Klebsiella oxytoca, Legionella pneumophila, Proteus vulgaris. - Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae
Arthur Kornberg
Scoprì la polimerasi I ed il meccanismo della sintesi del DNA, lavorando con Escherichia coli
Sono necessari quattro componenti:
1. dNTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP(deossribonucleoside 5’-trifosfato)(zucchero-base + 3 fosfati)
2. DNA stampo
3. DNA polimerasi I (chiamata anche enzima di Kornberg)(DNA polimerasi II e III scoperte successivamente)
4. Mg 2+ (ottimizza l’attività della DNA polimerasi)
LA REPLICAZIONE DEL DNA
• La polimerizzazione del DNA avviene sempre in direzione 5’-3’• L’elicasi si muove in una sola direzione, srotolando progressivamente l’elica• I due filamenti antiparalleli non possono essere duplicati nello stesso modo• uno puo’ essere sintetizzato nella stessa direzione in cui si muove l’elicasi, in direzione 5’-3’ (filamento guida )• l’altro non possiede un gruppo ossidrile 3’ al punto di biforcazione, non puo’ essere sintetizzato in maniera continua, in direzione 3’-5’ (filamento in ritardo ), seguendo l’elicasi 5’
5’ 3’
3’
3’
5’
5’
3’
direzioneelicasi
?
LA REPLICAZIONE DEL DNA
• Il filamento in ritardo viene invece sintetizzato in direzione opposta a quella in cui si muove la forchetta di replicazione, mediante la sintesi progressiva di una serie di piccoli frammenti (frammenti di Okazaki ), ciascuno polimerizzato in direzione 5’-3’• le estremita’ dei frammenti di Okazaki vengono ricongiunte mediante formazione di legami covalenti ad opera dell’enzima DNA ligasi
5’ 3’
5’3’
3’
5’
5’
3’
direzioneelicasi
27
5’3’
3’5’
Proteine alla forca replicazione in E. coli
Proteina Rep (elicasi)
proteine legantisingolo-filamento
(SSB)
BCG Primosoma
pol I
pol III
pol III
DNA ligasi
DNA girasi – questa è una topoisomerase II, cherompe e risalda il DNA per introdurre
superavvolgimenti negativi a monte della forca
primasi
DNAcDNAb
elicasi
Componenti dell’apparato di replicazionednaA lega all’origine la sequenza di DNAPrimosoma
dnaB elicasi (svolge il DNA all’ origine)dnaC lega dnaBdnaG primasi (sintetizza RNA primer)
DNA gyrase introduce superavvolgimenti negativi in testaalla forca di replicazione
Rep protein elicasi (svolge il DNA alla forca)SSB si lega al singolo-filamento di DNADNA pol III principale polimerasi replicanteDNA pol I rimuove i primer e riempe gli intervalliDNA ligasi risalda gli intervalli formando legami
3’, 5’-fosfodiesterei
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I superavvolgimenti sono un problema per la replicazione di cromosomi circolari
100 superavvolgimenti
Schema dei passaggi enzimatici nella replicazione di E. coli
1. La topoisomerasi fa rilassare il filamento2. La proteina iniziatrice si lega a ori-C3. Due elicasi (una per ciascuna forca replicativa) denaturano e
svolgono un tratto della doppia elica4. Le single-strand binding proteins stabilizzano il DNA ad elica
singola, senza coprire le basi5. La RNA polimerasi (primasi) si lega all’elicasi e sintetizza un
innesco di circa 30 paia di basi6. La DNA P III lo estende da 5’ a 3’7. Ad ogni passaggio la DNA P III rimuove gli appaiamenti
sbagliati (proof-reading)8. La DNA P I degrada l’innesco ed estende il frammento
adiacente, procedendo da 5’ a 3’9. La ligasi salda i filamenti adiacenti, senza aggiungere alcun
nucleotide
Il replicone è un segmento di DNA chepossiede un inizio di replicazione e sireplica una volta ad ogni divisionecellulare
Figura 3.9
Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A
Filamento leading e filamento lagging occupano entrambe le eliche, in posizioni diverse
Figura 3.10
Peter J Russell, Genetica © 2010 Pearson Italia S.p.A
Replicazione di cromosomi circolari
Nella foto: SV40
Ciclo cellulare in Eucarioti e procarioti (ore)
Organismo M G1 S G2 Totale
E. coli 1Lievito 20’ 25’ 40’ 35’ 2Piante 1 8 12 8 29Uomo 1 8 10 5 24
Velocità di replicazione:E. coli: 50000 basi al minutoDrosophila: 2600 basi al minutoTopo: 2200 basi al minuto
Il genoma umano è circa 1000 volte più grande di quello di E. coli
Negli eucarioti superiori
DNA P α: sintesi del primerDNA P β: riparazione del DNA nucleareDNA P γ: replicazione, solo nei mitocondri DNA P δ: sintesi dell’elica laggingDNA P ε: sintesi dell’elica leading*
* Finora dimostrato solo nel lievito
SPECIE Dimens. genoma N repliconi velocità replicazione/min
E. coli: 4,2 Mb 1 50000
Drosophila: 140 Mb 3500 2600
Topo: 3200 Mb 25000 2200
LA REPLICAZIONE DEL DNAOltre la parte piu’ estrema di un filamento di DNA non c’e’ piu’ spazio per la sintesi di un innesco!• Quindi la replicazione del DNA rimane incompleta, ovvero un frammento terminale di un cromosoma resta a singola elica• a questo ovvia la replicazione dei telomeri ad opera dell’enzimatelomerasi , che utilizza come stampo un RNA parte dell’enzima stesso
I telomeri sono delle strutture formate da DNA e
proteine presenti alle estremità dei cromosomi lineari
costituiti da ripetizioni in tandem della sequenza
TTAGGG
La replicazione dei La replicazione dei La replicazione dei La replicazione dei
telomeritelomeritelomeritelomeri
TelomerasiLa telomerasi, la trascrittasi inversa che aggiunge ripetizioni TTAGGG alle sequenze telomeriche, è ilmaggior regolatore della lunghezza telomerica nelle cellule di mammifero (collins & mitchell 2002).
Consiste di due componenti principali:
Il 90% dei tumori presentano attivazione della telo merasi
Nell’uomo l’attività telomerasica è stata riscontrata nelle cellule della linea germinale ed in cellule embrionali ma non nella maggior parte dei tessuti adulti
TERT (Telomerase Reverse Transcriptase) - una subunità con attività di trascrittasi inversa conosciuta come trascrittasi inversa telomerasica
TERC (Telomerase RNA component) - una molecola di RNA conosciuta come il componente ad RNA della telomerasi che serve da copia per la sintesi di nuove
ripetizioni telomeriche.
LA TELOMERASI
La telomerasi permette di risolvere il problemadella replicazione delle estremità cromosomicheaggiungendo ripetizioni telomeriche ad ogni ciclo disintesi del DNA
TelomerasiLe regioni terminali dei cromosomi (telomeri) contengono sequenzeripetute:Ciliati (Tetrahymena): n(TTGGGG)Flagellati (Trypanosoma), uomo: n(TTAGGG)
L’enzima telomerasi contiene un tratto di RNA complementare allasequenza ripetuta e lo usa come primer per replicare l’estremitàtelomerica 5’: è unaDNA P – RNA dipendente
Carol Greider
Figure 12.23b The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Xeroderma pigmentosumaltissima incidenza di maligni della pelle espostaa raggi UV.
Figure 12.8a The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Mismatch repair
Hereditary non-polyposiscolon cancer (HNPCC).
Difetti del mismatch repairnel 15% dei tumori sporadicidel colon, dello stomaco,dell'ovaio e dell'endometrio.
Figure 12.32 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Homology-directed repair
Difetti di BRCA1 o BRCA2prevengono la riparazione guidatadall'omologia.
Carcinomi della mammella edell'ovaio.
Figure 12.33 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Non-homologous end joining (NHEJ)
Difetto della proteina NBS(nibrina).
Linfomi.
Sistemi di correzione e riparo del DNA
Correzione di bozze (“proofreading”) – durante la replicazione la DNA polimerasi può eliminare una base incorretta attraverso l’attività 3’-5’ fosfodiesterasica
Riparo dei misappaiamenti – le coppie di basi non corrette sul filamento nuovo vengono riparate da un complesso proteico che segue la polimerasi in duplicazione. La metilazione del DNA consente di distinguere il filamento vecchio dal nuovo.
Riparo per escissione – le basi modificate da agenti chimici successivamente alla replicazione del DNA vengono riconosciute e riparate.
Causa delle mutazioni
• Errori di replicazione• Danni chimici. Il DNA è una molecola
fragile: perdita o alterazioni di basi, rottura dello scheletro
• Inserimento di trasposoni .
Riparazione del mismatch
Mismatch repair è parte della replicazione.
In E. coli il DNA viene analizzato per distorsioni da Mut S (un dimero), lo distorce ulteriormente
Recluta MutL , che recluta MutH che taglia il filamento vicino al mismatch
Poi intervengono: elicasi, esonucleasi, DNA Pol (III) e ligasi.
Mismatch repair in E. coli
Come fa a identificare il filamento nuovo su cui operare il taglio ed escissione?
Dalla metilazione della A nella sequenza CTAG ad opera della Dam metilasi
MutS si lega al filamento non metilato