UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI PADOVA Sede Amministrativa: Università degli Studi di Padova Sede Consorziata: Università degli Studi “Federico II” di Napoli Dipartimento di Chimica Biologica DOTTORATO DI RICERCA FISIOLOGIA MOLECOLARE E BIOLOGIA STRUTTURALE CICLO XX Caratterizzazione strutturale del sistema redox Tioredossina/Tioredossina Reduttasi dall'archaeon Sulfolobus solfataricus Coordinatore: Ch.mo Prof. Benedetto Salvato Supervisori: Ch.mo Prof. Adriana Zagari Ch.mo Dott. Luigi Vitagliano Dottorando: Dott.ssa Maria Angela Lanzotti
Transcript
UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI PADOVA
Sede Amministrativa: Università degli Studi di Padova
Sede Consorziata: Università degli Studi “Federico II” di Napoli
Dipartimento di Chimica Biologica
DOTTORATO DI RICERCA
FISIOLOGIA MOLECOLARE E BIOLOGIA
STRUTTURALE
CICLO XX
Caratterizzazione strutturale del
sistema redox Tioredossina/Tioredossina Reduttasi
dall'archaeon Sulfolobus solfataricus
Coordinatore: Ch.mo Prof. Benedetto Salvato
Supervisori: Ch.mo Prof. Adriana Zagari
Ch.mo Dott. Luigi Vitagliano
Dottorando: Dott.ssa Maria Angela Lanzotti
II
Indice
Riassunto............................................................................................................................................................. VI
Abbreviazioni e simboli .................................................................................................................................... IX
Premessa ............................................................................................................................................................. X
1.1.2 Studio dei meccanismi molecolari alla base della stabilita' di proteine da organismi estremo fili.................................................................................................................................................. 16
1.2 La super famiglia delle tioredossine ................................................................................................... 18
1.3 Il sistema redox Tioredossina-Tioredossina Reduttasi ....................................................................... 23
1.4 Il ponte disolfuro..................................................................................................................................... 31
1.5 Il sistema redox Tioredossina-Tioredossina Reduttasi nell’organismo ipertermofilo S.solfataricus......................................................................................................................................................................... 34
2.1.1 La Tioredossina Reduttasi di E.Coli ............................................................................................... 42
2.1.2 SsTrxR(B3): una proteina con due funzioni.................................................................................. 44
2.2 Materiali e metodi ................................................................................................................................. 48
2.2.1 Preparazione e purificazione di SsTrxR(B3) e del derivato di SsTrxR(B3) contenente la selenio metionina..................................................................................................................................... 48
2.2.2 Cristallizzazione di SsTrxR(B3) ......................................................................................................... 49
2.2.3 Registrazione ed analisi statistica dei dati cristallografici di SsTrxR(B3) ................................. 50
2.2.4 Risoluzione ed affinamento cristallografico di SsTrxR(B3)......................................................... 51
2.2.5 Determinazione della stabilità di SsTrxR(B3) mediante la tecnica spettroscopica del Dicroismo circolare .................................................................................................................................. 52
III
2.2.6 Esperimenti di denaturazione chimica ....................................................................................... 52
3.1.1 La Tioredossina da E.Coli ............................................................................................................... 78
3.1.2 Trxm del cloroplasto da spinacio ................................................................................................. 79
3.2 Materiali e metodi ................................................................................................................................. 82
3.2.1 Preparazione e purificazione di SsTrxA2...................................................................................... 82
3.2.2 Attività enzimatica di SsTrxA2........................................................................................................ 83
3.2.3 Determinazione del potenziale redox di riduzione................................................................... 84
3.2.4 Misura della termofilicità................................................................................................................ 84
3.2.5 Cristallizzazione di SsTrxA2.............................................................................................................. 85
3.2.6 Registrazione ed analisi statistica dei dati cristallografici di SsTrxA2...................................... 86
3.2.7 Risoluzione ed affinamento cristallografico di SsTrxA2 ............................................................. 88
3.2.8 Determinazione della stabilità di SsTrxA2 mediante la tecnica spettroscopica del Dicroismo circolare .................................................................................................................................. 88
3.2.9 Esperimenti di denaturazione chimica ....................................................................................... 89
3.2.10 Analisi della struttura secondaria............................................................................................... 89
4.2 Materiali e metodi ............................................................................................................................... 105
4.2.1 Preparazione e purificazione di SsTrxA2.................................................................................... 105
4.2.2 Attività enzimatica di SsTrxA1...................................................................................................... 106
4.2.3 Determinazione del potenziale redox di riduzione................................................................. 106
4.2.4 Misura della termofilicità.............................................................................................................. 107
4.2.5 Cristallizzazione di SsTrxA1............................................................................................................ 107
4.2.6 Registrazione ed analisi statistica dei dati cristallografici di SsTrxA2.................................... 108
4.2.7 Affinamento cristallografico di SsTrxA1 ..................................................................................... 109
4.2.8 Determinazione della stabilità di SsTrxA2 mediante la tecnica spettroscopica del Dicroismo circolare ................................................................................................................................ 109
4.2.9 Esperimenti di denaturazione chimica ..................................................................................... 110
La cristallizzazione.......................................................................................................................................... 126
A.I.1 I cristalli proteici............................................................................................................................... 126
A.I.2 Principi generali della cristallizzazione di proteine.................................................................... 128
A.I.3 Tecniche di cristallizzazione .......................................................................................................... 130
Registrazione ed analisi dei dati di diffrazione ......................................................................................... 133
A.II.1. Strategie per raccolta dati: tecniche di criocongelamento.............................................. 133
A.II.2 Registrazione dei dati di diffrazione: sistema di rivelazione ................................................ 135
A.II.3 Elaborazione dei dati di diffrazione......................................................................................... 136
Appendice III .................................................................................................................................................. 139
Metodi di risoluzione strutturale................................................................................................................... 139
A.III.I La Risoluzione della struttura .................................................................................................... 139
A.III.2 Il metodo della sostituzione molecolare (MR) ...................................................................... 140
A.III.2.1 La funzione di rotazione .......................................................................................................... 142
A.III.2.2 La funzione di traslazione ........................................................................................................ 144
A.III.3 La diffrazione anomala a λ multipla (MAD) ............................................................................... 145
A.III.3.1Trattazione matematica del MAD ............................................................................................. 148
Appendice IV ................................................................................................................................................. 151
Tuttavia si dispone di informazioni piuttosto limitate sulle
Tioredossine Reduttasi di classe II isolate da organismi archaea.
Soltanto di recente sono stati effettuati studi di tipo funzionale sulle
TrxR apparteneti ad Aeropyrum pernix e Pyrococcus horikoshii.
Inoltre sempre di recente sono state caratterizzate dall’organismo
ipertermofilo Sulfolobus solfataricus due Tioredossine Reduttasi,
SsTrxR(B2) e SsTrxR(B3), oltre che una proteina contenente il
motivo strutturale conservato CXXC, con elevata identità di sequenza
con le altre TrxR, SsTrxR(B1). Tuttavia sembra che SsTrxR(B3) e le
tioredossine SstrxA2 e SstrxA1, costituiscono il sistema NADPH redox
all’interno di tale organismo.
SsTrxR(B3) è una flavo proteina composta da 323 amminoacidi con
un peso molecolare pari a 35kDa. L’enzima presenta un’elevata
omologia con le Tioredossine Reduttasi da eubatteri, archaea, e
41
eucarioti di livello inferiore. Dall’allineamento di sequenza con
proteine omologhe è risultato che l’enzima presenta un’elevata
identità con la TrxR di Sulfolobus tokodaii, che è pari a circa il 76%.
Al contrario presenta un’ identità di sequenza nettamente inferiore se
confrontata con enzimi di struttura nota quali, EcTrxR, AtTrxR, infatti
l’identità di sequenza è pari a circa il 25%.
Tab.2. Allineamento di sequenza multiplo di TrxR di classe II. I residui amminoacidi coinvolti nel legame con FAD e NADP sono evidenziati in vede e blu. Il sito attivo contenente il motivo strutturale CxxC è nella area rossa.
SsTrxR(B3), che in studi precedenti era stata identificata come una
proteina NADH ossidasi, nonostante sia altamente termostabile e
appartenga alla classe II delle Tioredossine Reduttasi presenta
inoltre un’ elevate identità di sequenza con alcune TrxR di classe I,
pari a circa il 30-35%. Sembra infatti che alcune proprietà funzionali
di SsTrxR(B3) siano molto simili a quelle presentate dalle TrxR
eucariote ad alto peso molecolare. Questa osservazione è correlata
alla precedente ipotesi che il gene di Solfolobus solfataricus sia il
putativo ancestore del mitocondrio animale. Tuttavia è interessante
notare che SsTrxR(B3) presenta oltre all’attività disolfuro ossido
reduttasi, possiede un’ ampia attività NADH ossidasi. Allo scopo di
comprendere le relazioni esistenti tra la struttura e le proprietà
funzionali di questa classe di enzimi, nell’ambito di questa tesi, sono
state condotte indagini cristallografiche e spettroscopiche su
42
SsTrxR(B3) e i risultati di tali studi saranno ampiamente descritti nei
paragrafi che seguono.
2.1.1 La Tioredossina Reduttasi di E.coli
La Tioredossina Reduttasi da E.coli, EcTrxR è un enzima
appartenente alla famiglia delle flavo proteine ad attività disofuro
ossido reduttasi.
EcTrxR esplica la propria funzione biologica come omodimero,
ciascun monomero ha uno stato foldato del tipo αβα, di peso
molecolare pari a 35000Da, e presenta due domini, uno deputato al
legame con il gruppo prostetico FAD (FAD domain), l’altro
contenente il sito di legame per il nucleotide piridinico NADPH
(NADPH domain). Entrambi i siti di legame mostrano delle similitudini
con gli stessi siti di legame presenti nella proteina Glutatione
Reduttasi (GR), considerata come la proteina prototipo dei flavo
enzimi, tuttavia in EcTrxR il sito attivo contenente il ponte disolfuro è
collocato nel NADPH domain, mentre nella GR è collocato nel FAD
domain. Tale differenza comporta due distinti meccanismi di catalisi.
Il meccanismo di catalisi adottato da EcTrxR si svolge attraverso
l’alternarsi della conformazione dell’enzima tra due diversi
arrangiamenti strutturali dei due domini. La determinazione della
struttura cristallografica della forma ridotta (FR) e ossidata (FO) di
TrxR ha consentito di comprendere ampiamente il meccanismo
catalitico esercitato da tale enzima.
Nella struttura cristallografica risolta a 2 Å, della forma ossidata di
EcTrxR, il ponte disolfuro formato dai residui di cisteina, Cys135 e
Cys138, è localizzato nelle vicinanze dell’anello flavinico. Questa
conformazione consente il trasferimento elettronico dall’anello
flavinico, che è in forma ridotta, al ponte disolfuro.
La struttura ossidata di EcTrxR è stata denominata FO, poiché in tale
conformazione è possibile l’ossidazione dell’anello flavinico da parte
del ponte disolfuro. Tuttavia il ponte disolfuro è nascosto per cui
nello stato FO, non è possibile per l’enzima l’interazione con il proprio
43
substrato, la Tioredossina. Inoltre in tale struttura l’anello
nicotinamminico del NADP+ è distante dal FAD, per cui non è
consentito il trasferimento di elettroni dal nucleotide piridinico al
gruppo prostetico.
La struttura ridotta denominata FR, in cui l‘enzima è in una
conformazione tale da poter effettuare la riduzione del gruppo
prostetico FAD, e al contempo interagire con la Tioredossina, è stata
successivamente risolta a 3 Å, a partire dal complesso EcTrxR-Trx.
Dall’analisi strutturale è emerso che l’enzima per esplicare la propria
attività catalitica, deve alternarsi tra due stati confomazionali dovuti
al notevole riarrangiamento dei due domini l’uno rispetto all’altro.
In sostanza per ottenere la forma FR, è stata utilizzata la
Tioredossina che attraverso un ponte disolfuro misto costituito dal
residuo di cisteina 32 della EcTrx e il residuo di cisteina 138 di
EcTrxR, ha immobilizzato l’enzima nello stato FR. Per simulare il
legame con il nucleotide piridinico NADPH, i cristalli sono stati fatti
crescere in presenza di un analogo del NADPH, la 3-amminopiridina
nucleotide fosfato (ADP+).
Dal confronto tra lo stato FO e lo stato FR, è emerso, come già
anticipato, che la variazione conformazionale è una condizione
necessaria per lo svolgersi dell’attività catalitica dell’enzima. Infatti
nel passaggio dalla forma FO alla forma FR, il dominio contenente il
sito di legame per il NADPH, ruota di circa 66° intorno ad un
ipotetico asse che è perpendicolare all’interfaccia tra i due domini, e
si avvicina di circa 1,4 Å al dominio contenente il sito di legame per il
FAD. L’anello piridinico del nucleotide ADP+ legato all’enzima, in tale
conformazione è vicino al FAD, in un orientazione che gli permette la
riduzione dell’anello flavinico. Inoltre nella conversione dalla forma
FO alla forma FR, le interazioni di legame tra i due domini si
distruggono e nuovi contatti si ristabiliscono. L’area all’interfaccia tra
i due domini si riduce notevolmente, da circa 1000 Å2 passa a circa
630 Å2, il che consente l’esposizione del NADPH domain affinchè
possa avvenire l’interazione con la Tioredossina.
44
In conclusione è interessante notare che EcTrxR, tramite la
rotazione del dominio, ha escogitato una strategia completamente
differente per attendere al meccanismo di catalisi, se paragonata a
quella esplicata dalla GR e le Tioredossine Reduttasi ad alto peso
molecolare di struttura nota.
Infatti nella Glutatione Reduttasi il meccanismo di trasferimento di
elettroni dal NADPH al ponte disolfuro tramite il FAD, non necessita
di alcuna variazione conformazionale. Nella struttura della GR il
NADPH è posizionato da un lato dell’anello isoallossazinico, mentre il
ponte disolfuro è localizzato frontalmente all’altra faccia dell’anello.
Inoltre il ponte disolfuro è posizionato in una zona direttamente
accessibile ai substrati di piccole dimensioni.
Per quanto riguarda le Tioredossine Reduttasi ad alto peso
molecolare, la TrxR umana e quella caratterizzata dal parassita
Plasmodium falciparum, sono omologhe alla proteina Glutatione
Reduttasi, e oltre ad avere il sito attivo nel FAD domain,
interagiscono con un ampio numero di substrati. Tuttavia per
stabilire un contatto tra il ponte disolfuro ridotto dal FAD e il
substrato Tioredossina, questi enzimi utilizzano un secondo gruppo
mediatore ad attività redox che non è presente in E.Coli.
In sostanza EcTrxR e TrxR da cellule di mammifero, hanno sviluppato
meccanismi differenti per il trasferimento di equivalenti riducenti dal
gruppo prostetico FAD, ai rispettivi substrati.
2.1.2 SsTrxR(B3): una proteina con due funzioni
SsTrxR(B3) si distingue per diversi fattori dalle proteine omologhe
appartenenti ad altri organismi. In particolare l’enzima presenta due
distinte attività biochimiche, un’attività Tioredossina Reduttasica
tipica di questa classe di proteine, e un’attività NADH ossidasica che
al contrario è una proprietà che può definirsi atipica.
Nel presente paragrafo viene descritta la caratterizzazione dell’attività
enzimatica di SsTrxR(B3) così come riportato nel lavoro pubblicato
qualche anno fa da Masullo et al.
45
Le analisi condotte su SsTrxR(B3) per valutare l’attività enzimatica,
sono state effettuate a 65°C e monitorate cineticamente.
L’attività NADH ossidasica di SsTrxR(B3) è stata determinata
spettrofotometricamente misurando la velocità iniziale di ossidazione
del NADH. La miscela di reazione è stata preparata aggiungendo
0.18 M di FAD, 1mM di NADPH e portata al volume finale di 1 ml in
un tampone contenente 25mM di MES/KOH, pH 5.5. La reazione ha
avuto inizio aggiungendo l’enzima ed è stata monitorata
cineticamente misurando la decrescita del segnale di assorbanza a
340nm. La determinazione della concentrazione di perossido
d’idrogeno prodotto dall’enzima è stata effettuata, dopo aver tenuto
in incubazione la miscela di reazione per 30 minuti a temperatura
ambiente, tramite la misura dell’assorbimento a 500nm e calcolata
dalla curva di calibrazione.
L’attività Tioredossina Reduttasica è stata invece valutata attraverso
due differenti metodi, la riduzione dell’acido 5,5-ditiobis-2-
nitrobenzoico, DTNB e la riduzione della Tioredossina. Nella reazione
di riduzione del DTNB è stata monitorata la produzione di 2-nitro-5-
tiobenzoato (TNB), attraverso la misura dell’incremento del segnale
di assorbanza alla lunghezza d’onda di 412nm. Per misurare l’attività
enzimatica è stato utilizzato un coefficiente di estinzione molare
differente da quello calcolato nel metodo standard di riduzione del
DTNB, determinato utilizzando un tampone contenente 25mM di
Mes/KOH, pH 5.5. La miscela di reazione è stata preparata
aggiungendo 5mM di DTNB, 0.25mM di NADPH, 0.05 MM di FAD,
10mM di EDTA, e portata ad un volume finale di 1ml in un tampone
contenente 25mM di Mes/KOH, pH 5.5. Negli esperimenti di riduzione
della Tioredossina, la miscela di reazione è stata preparata
aggiungendo 0.2mM di EcTrx, 0.05mM di FAD, 2 mM di EDTA, la
quantità appropriata di SsTrxR(B3) e portata ad un volume finale di
1ml in un tampone contenente 25mM di Mes/KOH, pH 5.5. La
reazione è iniziata a partire dall’aggiunta di 0.1 mM di NADPH.
L’attività enzimatica è stata calcolata misurando la decrescita del
46
segnale di assorbanza alla lunghezza d’onda di 340nm e utilizzando
un valore del coefficiente di assorbanza pari a 6220 M-1cm-1. Il
segnale di riferimento dovuto alla stessa miscela di reazione in
assenza dell’enzima è stato registrato in contemporanea e sottratto
al segnale relativo alla reazione di riduzione.
Fig.2.1. Riduzione di DTNB e EcTrx catalizzata da rSsTrxR. La reazione è stata monitorata seguendo il metodo della riduzione di DTNB (isogrammi A, B, C, D) o il metodo della riduzione della Tioredossina (istogrammi E, F). entrambi gli esperimenti sono stati condotti in presenza di rSsTrxR, 20mg/ml, soltanto NADPH(A); NADPH e FAD (50µM)(B); NADH(50µM)(C); NADH e FAD(D); NADPH(100µM) e FAD(E);NADPH; FAD, e EcoliTrx (200µM)(F).
47
Fig.2.2. Reazione di formazione di perossido d’idrogeno per diverse aggiunte di NADH.
NADH + H+ + O2 -> NAD+ + H2O2
L’inibizione dell’attività enzimatica di SsTrxR(B3) è stata misurata in
presenza di specifici inibitori delle TrxR, auranofina e acido azelico, e
altri agenti riducenti (ditiotreitolo, DTT o β-mercaptoetanolo, β-ME).
Le soluzioni stock contenenti 9mM di auranofina, e 7mM di acido
azelaico sono state preparate diluendo i reagenti in soluzioni
contenenti acqua e dimetilsolfossido (DMSO). L’inibizione dell’attività
Tioredossina Reduttasica è stata valutata per entrambi i metodi di
riduzione utilizzati. Ciascun inibitore è stato incubato in presenza
dell’enzima, SsTrxR(B3), per circa 1 minuto a 60°C,
precedentemente all’aggiunta del substrato.
48
2.2 Materiali e metodi
2.2.1 Preparazione e purificazione di SsTrxR(B3) e del derivato di SsTrxR(B3) contenente la selenio metionina
La preparazione della forma ricombinante della Tioredossina
Reduttasi da S.solfataricus, è stata effettuata in collaborazione con i
Proff. M. Masullo e P. Arcari, presso i laboratori del Dipartimento di
Biochimica e Biotecnologie Mediche di Napoli. Di seguito è
brevemente, descritta la procedura utilizzata.
Il vettore di espressione pSsTrxR contenente il gene codificante per
SsTrxR(B3) è stato utilizzato per trasformare ceppi E. coli BL21(DE3),
successivamente fatti crescere a 37°C in Luria-Bertani medium.
L’aggiunta di isopropil-β-D-tiogalattopiranoside (IPTG) ha provocato
una notevole precipitazione di proteina ricombinante insolubile per
cui l’induzione tramite IPTG è stata evitata. Le cellule batteriche sono
state raccolte tramite centrifugazione a 3000*g per 15 minuti a 4 °C
e risospese in 20 ml di un tampone contenente 20mM Tris-HCl pH
7.8, 5mM MgCl2, 50mM KCl e 1 mM PMSF. Le cellule sono state
distrutte attraverso un sistema di rottura cellulare meccanica.
L'omogenato cellulare é stato centrifugato a 100,00*g per circa due
ore ed il sovranatante post-ribosomale ottenuto, é stato trattato per
30 min a 70°C. Dopo aver allontanato mediante centrifugazione le
proteine di E.coli, denaturate dal trattamento termico, il
supernatante è stato dializzato in un tampone contenenente 25mM
Mes/KOH, pH 5.5. Successivamente il campione è stato caricato su
una colonna mono S a scambio cationico collegata ad un sistema
FPLC, operante a temperatura ambiente. L’eluizione è stata condotta
mediante un gradiente di KCl (0-200mM). Le frazioni che mostravano
la presenza di un'unica banda elettroforetica, su gel di
poliacrilammide in condizioni denaturanti (SDS-PAGE; Laemmli,
1970), sono state riunite e concentrante mediante Aquacide II. Dopo
essere stato dializzato in un tampone contenente 20 mM Tris
(pH7.8), e 50% (v/v) glicerolo, il campione è stato conservato a -
49
20°C. In queste condizioni l'attività si è mantenuta per diversi mesi. Il derivato di SsTrxR(B3) contenente la seleniometionina, è stato
preparato facendo crescere il vettore di espressione di E.coli
contenente il gene codificante l’enzima ricombinante, in una coltura
costituita da 1 mg l-1 di vitamine (riboflavina, niacinammide,
piridossine monoidroclorata and tiammine), 0.4% di glucosio, 2 mM
di MgSO4, 0.1 mM di CaCl2, 50 mg l-1 dei seguenti amminoacidi,
fenilalanina, treonina, lisina, isoleucina, leucina e valina, e 60 mg l-1
di selenio-L-metionina.
2.2.2 Cristallizzazione di SsTrxR(B3)
La trattazione teorica della cristallizzazione di proteine è riportata in
dettaglio nell’Appendice I. Di seguito sono descritte brevemente le
condizioni di cristallizzazione di SsTrxR(B3) ricombinante ottenuto
attraverso la procedura appena descritta.
Gli esperimenti di cristallizzazione sono stati condotti a 293K usando i
metodi di cristallizzazione del microbath sott’olio e della diffusione in
fase vapore, hanging drop. Prove preliminari di cristallizzazione sono
state effettuate utilizzando un KIT reperibile in commercio
contenente soluzioni precipitanti a matrice sparsa (Crystal screen kits
I and II, Hampton Research).
Allo scopo di determinare la struttura di SsTrxR(B3) legata al
cofattore nucleotide piridinico, i cristalli di proteina sono stati fatti
crescere aggiungendo alla soluzione precipitante il NADP+. Le
aggiunte del cofattore sono state fatte in modo che il rapporto
stechiometrico molare NADP+/proteina fosse circa pari a 100.
Sono stati ottenuti cristalli adatti per un analisi cristallografica da una
soluzione precipitante contenente 15% (w/v) di monometiletere
polietilenglicole 2000, (PEGmmE 2K), 0.1 M di solfato d’ammonio,
(NH4)2SO4, 50 mM di acetato di sodio. Nelle Figure 2.3 e 2.4 sono
riportate le immagini dei cristalli ottenuti nelle condizioni di
cristallizzazione sopradescritte.
50
Le stesse condizioni di cristallizzazione della forma nativa sono state
utilizzate con successo per ottenere i cristalli del derivato di
SsTrxR(B3) contenente le seleniometionina.
Per prevenire l’ossidazione del derivato, alla soluzione precipitante è
stato aggiunto l’agente riducente DTT (5mM).
Fig.2.3. Cristalli di SsTrxR(B3), Forma I
Fig.2.4. Cristalli di SsTrxR(B3), Forma II
2.2.3 Registrazione ed analisi statistica dei dati cristallografici di SsTrxR(B3)
Dati di diffrazione preliminari sono stati registrati in house a 298 K,
utilizzando un registratore di immagini ad area MacScience Dip
2030b, collegato ad un generatore di radiazioni Cu Kα di lunghezza
d’onda pari a 1.5418 Å, Nonius FR591. Successivamente sono stati
51
raccolti dati a più alta risoluzione presso il sincrotrone di Grenoble, a
100 K (beam-line ID29). I cristalli sono stati congelati aggiungendo
alla soluzione tampone di cristallizzazione, glicerolo al 22% (v/v). I
dati di diffrazione sono stati raccolti utilizzando il metodo della
diffusione anomala, MAD, presso la postazione ID14-4 del
sincrotrone di Grenoble, ESRF.
Sono stati registrati tre differenti set di dati utilizzando i valori di
lunghezza d’onda determinati dallo spettro di assorbimento del
selenio. L’analisi statistica dei dati di diffrazione è stata effettuata
mediante l’utilizzo del programma DENZO (Otwinoski and Minor,
1997).
Fig.2.5. Pattern di diffrazione di SsTrxR(B3)
2.2.4 Risoluzione ed affinamento cristallografico di SsTrxR(B3)
La struttura dell’enzima è stata risolta utilizzando il metodo MAD, che
si basa sul segnale anomalo generato dal selenio presente nel
derivato di SsTrxR(B3) contenente la seleniometionina. Tramite il
programma SOLVE (Terwilliger & Berendzen, 1999) è stato possibile
determinare la posizione del selenio nell’unità asimmetrica e da ciò
dedurre i valori sperimentali degli angoli di fase. I valori delle fasi
sono stati successivamente ottimizzati effettuando delle modifiche
52
della densità elettronica tramite il programma DM (Cowtan & Main,
1998). La costruzione automatica del modello è stata eseguita
utilizzando il programma, ARP/wARP (Perrakis et al., 1999).
2.2.5 Determinazione della stabilità di SsTrxR(B3) mediante la tecnica spettroscopica del Dicroismo
circolare
Tutte le misure spettroscopiche sono state registrate con uno
spettropolarimetro Jasco J-810 provvisto di un sistema Peltier per il
monitoraggio della temperatura (modello PTC-423-S). La
concentrazione delle proteine è stata determinata misurando
l’assorbanza a 280 nm, mediante uno spettrofotometro Jasco J-550.
Le curve di denaturazione indotte da urea e da guanidinio
idrocloruro, GuHCl, a temperatura costante, sono state ottenute
registrando la variazione del segnale CD a 222 nm a 20°C. La curva
di denaturazione termica è stata registrata misurando la variazione
del segnale CD nell’intervallo 40-105°C a λ=200 nm e a λ=222 nm
con una velocità di scansione di 1.0°C min-1
2.2.6 Esperimenti di denaturazione chimica
Entrambi i denaturanti urea e guanidinio idrocloruro (GuHCl) sono
stati acquistati come prodotti ultrapuri dalla ditta Sigma: il cloruro di
guanidinio come soluzione acquosa 8 M, mentre l’urea come solido.
Le soluzioni di urea sono state preparate solubilizzando una quantità
nota nella soluzione tampone, dopo aver essiccato il solido per circa
due ore sotto vuoto su P2O5. Le concentrazioni delle soluzioni sono
state determinate attraverso le misure degli indici di rifrazione (Pace
1986). E’ stato necessario preparare le soluzioni di urea al momento
dell’uso a causa dei fenomeni di decomposizione in ammonio e
cianato. Infatti, già dopo una settimana dalla preparazione della
soluzione lo ione cianato è presente in concentrazioni apprezzabili e
può modificare i gruppi amminici della proteina. Per la costruzione di
ogni curva di denaturazione sono state preparate e analizzate diverse
53
soluzioni con una concentrazione di proteina costante e una
concentrazione crescente di denaturante, compresa tra 0.0 e 9.6 M
di urea o tra 0.0 e 7.0 M di cloruro di guanidinio. In particolare, a 10-
20 µL della soluzione madre di proteina sono stati aggiunti l’agente
denaturante, quindi il tampone fosfato fino al volume finale di 500
µL. Siccome elevate concentrazioni di urea e di cloruro di guanidinio
fanno variare il pH, per ogni singolo campione il pH è stato corretto
aggiungendo opportune quantità di soluzioni concentrate di HCl
oppure di NaOH. Inoltre i campioni sono stati miscelati e incubati per
una notte a 4 °C. Un’incubazione più lunga produce segnali CD e di
fluorescenza sovrapponibili.
2.3 Risultati
2.3.1 Proprietà catalitiche di SsTrxR(B3)
SsTrxR(B3) è in grado di catalizzare l’ossidazione del NADH in
presenza di ossigeno molecolare dando come prodotto di reazione
perossido d’idrogeno. Una concentrazione stechiometrica di H2O2
viene prodotta in seguito alla completa ossidazione del NADH, ciò
implica che l’enzima trasferisce due elettroni equivalenti alla molecola
d’ossigeno. L’enzima per reagire necessita tuttavia della presenza del
cofattore FAD. SsTrxR(B3) è in grado inoltre di catalizzare anche la
reazione di ossidazione del NADPH, ma la velocità di reazione è di
due ordini di grandezza più piccola rispetto all’ossidazione del NADH.
Per quanto concerne l’attività Tioredossina Reduttasica tale attività è
stata misurata sia in presenza che in assenza del cofattore FAD. I
risultati emersi dagli esperimenti condotti per misurare l’attività
catalitica dell’enzima hanno mostrato che il massimo dell’attività si
svolge in presenza di entrambi i cofattori, FAD e NADPH. In sostanza
gli esperimenti condotti hanno dimostrato che l’enzima è dotato di
attività Tioredossina Reduttasica. E’ interessante notare che
SsTrxR(B3) precedentemente identificato come NADH ossidasi fa
54
parte della famiglia delle Tioredossine Reduttasi di classe II ed è
dotato di entrambe le attività catalitiche, NADH-ossidasica,
Tioredossina Reduttasica.
2.3.2 Determinazione della struttura cristallografica di SsTrxR(B3)
I primi risultati degli esperimenti di cristallizzazione effettuati su
SsTrxR(B3) hanno rivelato che l’enzima è in grado di cristallizzare in
condizioni differenti. La qualità dei cristalli è stata migliorata variando
leggermente le concentrazioni della proteina e dell’agente
precipitante rispetto alle condizioni iniziali che avevano determinato
la formazione dei primi cristalli. Cristalli di grosse dimensione di
colore giallo vivo (forma I, vedi figura) si sono formati in una
(w/v) (PEG mmE 2K), 0.1 M di solfato d’ammonio (NH4)2SO4 e 50
mM di acetato (pH 4.6). Cristalli di forma differente invece sono
cresciuti in una soluzione contenente polietilenglicole 4000 8-12%
(w/v), 2-propanolo 3-4% (v/v) e 50 mM HEPES-Na (pH 7.5) (vedi
figura). In entrambi i casi la concentrazione di proteina è compresa
nell’intervallo di 4-9 mg ml-1. Utilizzando il metodo di calcolo del
coefficiente di Matthews (Matthews, 1968) è stato possibile
determinare la presenza di due molecole dimeriche di SsTrxR(B3)
nell’unità asimmetrica nei cristalli di forma I, (Vm = 2.1 Å3 Da-1, con
un contenuto di solvente pari al 41%); mentre nei cristalli di forma II
è presente un solo dimero di SsTrxR(B3) nell’unità asimmetrica (Vm
= 2.7 Å3 Da-1, con un contenuto di solvente pari al 55%). Le due
forma cristalline di SsTrxR(B3) mostrano un elevata differenza per
quanto concerne il grado di mosaicità e il limite di diffrazione. Infatti,
le forme cristalline I e II hanno valori di mosaicità pari
rispettivamente 0.31 e 0.68°. Mediante la luce di sincrotrone presso
ESRF i cristalli di forma I e II hanno diffratto a 1.8 and 2.5 Å di
risoluzione rispettivamente. La migliore qualità dei cristalli di forma I
ha indotto ad effettuare successivi esperimenti di cristallizzazione
55
nelle medesime condizioni per ricristallizzare SsTrxR(B3), in presenza
del cofattore NADP+ ed una forma mutata dell’enzima, C147A.
Tuttavia nonostante sia stato preso tale accorgimento, i parametri di
cella dei cristalli ottenuti in presenza del cofattore, sono risultati
leggermente differenti da quelli determinati per la proteina nativa.
Tale risultato è stato considerato come la prova che il NADP+ è
legato all’enzima.
Differenti tentativi sono stati effettuati per risolvere la struttura
tridimensionale di SsTrxR(B3) mediante il metodo della sostituzione
molecolare a partire dai dati di diffrazione dei cristalli di forma I. In
particolare nell’applicazione del metodo della sostituzione molecolare
sono stati utilizzati come modelli di partenza le strutture di E.coli
TrxR (Protein Data Bank code 1TDF) (Waksman et al., 1994) e
A.thaliana TrxR (PDB code 1VDC) (Dai et al., 1996). Tuttavia
entrambi i tentativi non hanno dato i risultati attesi. Infatti la bassa
identità di sequenza tra i modelli utilizzati e SsTrxR(B3) (33-35 %) e
la presenza di ben quattro molecole all’interno dell’unità asimmetrica
hanno reso piuttosto complicata la risoluzione della struttura.
Dal momento che il metodo della sostituzione molecolare non era
sembrato adatto per la risoluzione della struttura tridimensionale di
SsTrxR(B3), è stato ritenuto opportuno ricorrere ad un altro metodo,
che si basa sulla diffusione anomala (MAD).
L’applicazione del MAD permette, mediante l’utilizzo di dati di
diffrazione registrati a tre diversi valori di lunghezza d’onda, di
effettuare il calcolo degli angoli di fase. La presenza di tre residui di
metionina nella sequenza amminoacidica dell’enzima sembrava infatti
avvalorare il ricorso a questa metodologia alternativa per risolvere la
problematica della determinazione delle fasi. Allo scopo di
determinare il picco di assorbanza e la lunghezza d’onda in
corrispondenza del punto di flesso, è stato registrato lo spettro di
fluorescenza su un singolo cristallo della forma derivata di
SsTrxR(B3) contenente la selenio metionina. Utilizzando il set di dati
di diffrazione registrati ad un valore di lunghezza d’onda ottimizzato
56
per generare la diffusione anomala del selenio, tramite il programma
SOLVE è stato possibile identificare la posizione dei 12 siti contenenti
il selenio che si attendeva di trovare all’interno dell’unità
asimmetrica.
L’arrangiamento di tali siti ha confermato la presenza di due dimeri di
SsTrxR(B3) all’interno dell’unità asimmetrica. Il programma SOLVE
(Terwilliger & Berendzen, 1999) ha inoltre consentito di determinare
il set iniziale di angoli di fase. Successivamente la modifica della
densità elettronica effettuata mediante il programma DM (Cowtan &
Main, 1998) ha prodotto una densità elettronica di eccellente qualità.
A partire da tale densità è stato infine possibile, mediante l’utilizzo
del programma ARP/wARP (Perrakis et al., 1999), ottenere in
maniera automatizzata la maggior parte della struttura dell’enzima. E’
in corso l’affinamento cristallografico del modello .
Fig.2.6. Analisi statistica dei dati cristallografici della proteina nativa, cristalli forma I e forma II (wild tipe); del complesso SsTrxR(B3) e il cofattore NADP+; del derivato di SsTrxR(B3) contenente la selenio metionina.
Crystal data, data collection and refinement statisticsValues given in parenthesis refer to the highest resolution shell.___________________________________________________________________________________________________________________________Crystal Wild-type Complex SeMet derivative C147A
with NADP Peak Edge Remote ____________________________________________________________________________________________________________________________Crystal data and data collection statisticsBeamline ESRF-ID29 ESRF-ID29 ESRF-ID14-4 ESRF-ID29Space Group P212121 P212121 P212121 P212121
Current refinement statisticsResolution range (Å) 20.0-1.80 20.0-1.9 20.0-1.75 20.0-1.5Rfactor/Rfree 0.197/0.234 0.286/0.31 0.228/0.249 0.205/0.218Number of monomers (u.a.) 4 4 4 4Number of water molecules 300 345 355Root mean square deviationsBonds 0.01479 0.006182 0.01945Angles (°) 1.611 1.1458 1.8637____________________________________________________________________________________________________________________________
_†Rmerge= Σ hΣi |I(h,i)-<I(h)>|/ Σ hΣi I(h,i), where I(h,i) is the intensity of the ith measurement of reflection h and <I(h)> is the mean value of the intensity of reflection h. For the SeMet derivative the Rmerge value has been calculated considering the Bijovet pairs individually.
57
2.3.4 Confronto della struttura di SsTrxR e EcTrxR
Per indagare sulle differenti proprietà funzionali e strutturali mostrate
da SstrxR(B3) rispetto altre TrxR di struttura nota, è stata comparata
la struttura dell’enzima con quella di EcTrxR, attraverso la
sovrapposizione di diverse regioni che costituiscono il singolo
monomero. In linea generale sembra che, nonostante l’enzima
presenti una bassa identità di sequenza con EcTrxR, la loro struttura
terziaria globale risulti essere piuttosto simile. Sovrapponendo i
domini strutturali contenenti il FAD, la posizione occupata dal NADPH
è piuttosto differente nelle due molecole. Tuttavia è sufficiente la
semplice rotazione del NADPH domain per sovrapporre i due domini.
La sovrapposizione dei quattro domini presenti nell’unità asimmetrica
mostra che il NADPH domain ha una struttura maggiormente
disordinata rispetto al FAD domain e tale osservazione è deducibile
dalla non ottimale sovrapposizione dei quattro domini contenenti il
sito di legame per il NADPH. Le osservazione riscontrate da queste
analisi strutturali sembrano avvalorare l’ipotesi che il NADPH domain
sia piuttosto flessibile in SsTrxR(B3).
58
Fig.2.7. Analisi comparativa del monomero strutturale di TrxR. Sovrapposizione dei due differenti monomeri presenti nell’unità asimmetrica di SsTrxRB3 (A) e EcoliTrxR. SsTrxRB3 è il monomero in rosso e TrxR e E. coliTrxR è il monomero in verde
59
Fig.2.8. Sovrapposizione dei FAD domain dei quattro monomeri presenti nell’unità
asimmetrica di SsTrxR(B3).
2.3.5 Descrizione della struttura complessiva di SsTrxR(B3)
All’interno dell’unità asimmetrica dei cristalli di forma I, sono presenti
due molecole di proteina dimerica. Ciascun monomero è costituito da
due distinti domini, caratterizzati da uno stato foldato piuttosto
simile. Un dominio contiene il sito di legame per NADPH, l’altro il sito
di legame per il FAD. I due domini sono caratterizzati dai motivi di
struttura secondaria α-elica e foglietto β. Il FAD è localizzato in una
regione nascosta e presenta una conformazione non facilmente
accessibile per l’ossidazione da parte del NADPH. Il sito attivo è
60
localizzato nel dominio contenente il sito di legame per il NADPH,
così come riscontrato nella Tioredossina Reduttasi da E.coli, e si
trova nelle vicinanze dell’anello isoallossazinico, infatti dista di circa 4
Å. Tale osservazione conferma che l’enzima è nello stato FO, ossia
nella conformazione adatta per promuovere l’ossidazione del FAD.
Il dominio contenente il FAD sembra apparentemente molto più
ordinato rispetto al dominio che lega il nucleotide piridinico. Infatti
tale dato emerge chiaramente dall’analisi dei fattori termici B dei due
domini, effettuata riportando in un grafico la variazione dei fattori B
rispetto ai residui amminoacidici che costituiscono la catena
principale della proteina.
Il dominio contenente il FAD sembra essere responsabile del
processo di dimerizzazione, infatti tale dominio si posizione
all’interfaccia tra i due monomeri stabilendo la maggior parte delle
interazioni.
Il dominio contenete il NADPH invece sembra svolgere un ruolo
importante nel processo di stabilizzazione del dimero. Tuttavia il
numero piuttosto basso di interazioni all’interfaccia tra i due domini
che caratterizzano ciascun monomero potrebbe spiegare il maggiore
disordine che presenta il dominio contenente il sito di legame per il
NADPH e quindi una maggiore mobilità in corrispondenza di tale
regione della struttura. Infatti il discreto numero di interazioni forti
con il dominio contenente il FAD potrebbe conferire maggiore
flessibilità al dominio contenente il NADPH. Infatti, così come
osservato nella Tioredossina Reduttasi da E.coli, la transizione tra lo
stato FO allo stato FR può avvenire soltanto in seguito alla rotazione
del NADPH domain rispetto al FAD domain. La variazione
conformazionale che comporta il riarrangiamento strutturale dei due
domini, sembra essere il meccanismo base per lo svolgimento
dell’attività enzimatica delle Tioredossine Reduttasi di classe II.
61
Fig.2.9. Struttura tridimensinale del dimero di SsTrxR(B3)
62
Fig.2.10. Fattori termici B in funzione del numero di residui amminoacidici
2.3.6 Descrizione del sito attivo
La mappa di densità elettronica calcolata in prossimità del sito attivo
ottenuta eliminando dalla struttura le coordinate relative al FAD ed ai
residui circostanti, mostra che il FAD si lega all’enzima assumendo
una conformazione piuttosto allungata e si impacchetta nelle
vicinanze del ponte disolfuro. La presenza del ponte disolfuro tra i
due residui di cisteina 144 e 147 è chiaramente deducibile dalla
distanza misurata tra i due atomi di zolfo cisteinici pari a circa 2 Å.
Tuttavia non è stato possibile definire a livello ottimale la densità
elettronica dell’anello isoallossazinico nei due monomeri. Infatti nella
figura riportata in basso è stato inserito l’anello isoalossazinico
all’interno della cavità e modellato nella posizione attesa per le
Tioredossine Reduttasi di classe II. Tuttavia poiché la densità
elettronica non descrive tale anello si è dedotto che nella proteina
nativa il FAD è disordinato e potrebbe trovarsi all’esterno della cavità.
Al contrario dall’analisi della mappa di densità elettronica del mutante
di SsTrxR(B3), C147A, che descrive il sito attivo, il FAD è
chiaramente visibile e l’anello isoalossazinico è ben delineato dalla
densità elettronica. Il FAD è molto più ordinato nella struttura del
63
mutante piuttosto che nella proteina nativa, e occupa la posizione
assunta all’interno di altre TrxR di struttura nota. Probabilmente nel
caso della proteina nativa le dimensioni ridotte della cavità
impongono all’anello isoallossazinico di spostarsi verso l’esterno, e
questo differente comportamento si traduce in un maggiore disordine
a livello locale.
64
.
Fig.2.11. Mappa Omit (Fo-Fc) della molecola di FAD legata alla proteina native SsTrxR(B3). L’anello isoallossazinico è localizzato nella posizione tipica osservata nelle tioredossine reduttasi da eucarya. Nella figura sono mostrati i residui cisteinici che formano il ponte disolfuro.
Cys144Cys147
65
Fig.2.12. Mappa omit (Fo-Fc ) della molecola di FAD legata al mutante SsTrxR(B3) C147A. Sono inoltre rappresentati i residui Cys144 and Ala147.
66
2.3.7 Struttura cristallografica del complesso SsTrxR-NADPH
La struttura risolta dell’enzima nativo a differenza di EcTrxR non
presenta la densità elettronica che attesta la presenza del cofattore
piridinico NADPH. Di conseguenza per ottenere i cristalli del
complesso SsTrxR(B3)-NADPH è stata aggiunta alla soluzione
precipitante il cofattore nucleotidico. Dall’analisi della struttura
cristallografica di SsTrxR(B3)-NADPH emerge chiaramente che
l’anello nicotinamminico è situato a circa 18 Å dall’anello
isoallossazinico, per cui l’elevata distanza tra i due cofattori
impedisce il trasferimento elettronico.
Fig.2.13. Struttura cristallografica del complesso SsTrxR e NADP
67
2.3.8 Analisi del contenuto di struttura secondaria
Lo spettro CD di SsTrxR(B3) misurato nel lontano UV mostra
chiaramente che l’enzima è dotato degli elementi di struttura
secondaria α-elica e β-sheet. Infatti il massimo a 195 mn ed il
minimo a 222 nm sono caratteristici di una struttura di tipo αβ.
Fig.2.14. Caratterizzazione spettroscopica di SsTrxRB3: spettro CD lontano UV.
f
2.3.9 Analisi della stabilità termica
La stabilità termica di SsTrxR(B3) è stata analizzata mediante lo
studio delle variazioni dello spettro CD a λ=200 nm e λ=222 nm
nell’intervallo 40-105°C. Queste due lunghezze d’onda sono scelte
190 200 210 220 230 240 250-15
-10
-5
0
5
10
15
20
25
[ϑ] (
deg c
m2 dm
ol-1)1
0-3
Wavelenght (nm)
68
per ottenere informazioni sull’effetto della temperatura sia sulle
regioni ad α-elica ([θ]220) che β-sheet ([θ]200) della proteina.
Poiché la denaturazione termica dell’enzima ha determinato la
precipitazione di SsTrxR(B3), non è stato possibile effettuare studi
termodinamici, tuttavia tali esperimenti hanno dimostrato che
l’enzima è stabile anche a temperatura superiore ai 90 °C.
Fig.2.15. Caratterizzazione spettroscopica di SsTrxRB3: spettro di denaturazione
termica.
2.3.10 Denaturazione chimica
Per valutare ulteriormente la stabilità conformazionale di SsTrxR(B3),
sono stati effettuati esperimenti di denaturazione chimica utilizzando
due diversi agenti denaturanti, GuHCl e urea. In particolare sono
stati registrati gli spettri CD di SsTrxR(B3) a temperatura ambiente
per diverse miscele proteine-agente denaturante (urea e cloruro di
guanidinio) a concentrazione variabile (2-8 M). L’analisi degli spettri
CD ha rivelato che in presenza dell’ urea l’enzima conserva la sua
stabilità anche per concentrazioni di agente denaturante superiori a 8
M. Al contrario in presenza di GuHCl, l’enzima non presenta un grado
di stabilità elevato. Infatti la proteina comincia a perdere il suo stato
foldato a partire da concentrazioni di GuHCL pari a 3 M. In
50 60 70 80 90 100-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
[ϑ] 22
2 (d
eg cm
2 dmol
-1)10
-3
Temperature (°C)
69
particolare la concentrazione di denaturante misurata a metà del
processo di transizione è pari a 2.9 M. L’esperimento conferma il
comportamento tipico delle proteine termostabili e il fatto che
l’enzima comincia a denaturare a valori bassi di concentrazione di
GuHCl potrebbe stare ad indicare che le interazioni elettrostatiche,
fortemente contrastate dalla presenza di GuHCl, giocano un ruolo
chiave nel processo di stabilizzazione termica di SsTrxR(B3).
Fig.2.16.a. Spettro CD registrato nel lontano UV della proteina nativa trattata con soluzioni diversamente concentrate di urea .
Fig.2.16.b. Spettro CD registrato nel lontano UV della proteina nativa trattata con
soluzioni diversamente concentrate di cloruro di guanidinio (GuHCl)
170 180 190 200 210 220 230 240 250 260
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
25
[ϑ] (
deg
cm2 dm
ol-1)1
0-3
Wavewlenght (nm)
0M Urea 5M Urea 6M Urea 7M Urea 8M Urea 9M Urea
190 200 210 220 230 240 250-15
-10
-5
0
5
10
15
20
25
[ϑ] (
deg
cm2 dm
ol-1)1
0-3
wavelenght (nm)
0 M GuHCl 1.5 M 2.0 M 3.2 M 3.8 M 4.5 M 5.5 M 6.0 M
70
Fig.2.16.c. Curva di denaturazione termica indotta da cloruro di guanidinio ottenuta
riportando la variazione di ellitticità molare a 222 nm in funzione della concentrazione di
GuHCl.
Da un’indagine strutturale approfondita è emerso che all’interfaccia
tra i due domini si trova un numero elevato di residui carichi che
formano un vero e proprio cluster dalla funzione probabilmente
stabilizzante, al contrario di quanto avviene in EcTrxR dove le uniche
interazioni forti interdominio riscontrate sono costituite da due legami
a idrogeno.
0 1 2 3 4 5
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
[GuHCl]1/2= 2.9 M
[ϑ] 22
2 (de
g cm
2 dmol
-1)1
0-3
[GuHCl] (M)
71
Ponti salini in SsTrxR(B3):
Lys124 - Glu46
Arg125 - Glu54
Arg125 - Glu54
Arg126 - Asp250
Fig.2.17. Cluster di ponti salini identificati in SsTrxR(B3)
2.3.11 Ponti salini e stabilità termica
Dagli studi riportati nel presente capitolo sembra che l’elevata
stabilità termica di SsTrxR(B3) sia strettamente legata alla presenza
di un numero elevato di ponti salini all’interno della struttura
tridimensionale dell’enzima rispetto alla omologa proteina mesofila
appartenente ad E.coli. Tale dato è in perfetto accordo con le ipotesi
più recenti, che sulla base di indagini di tipo statistico ed empirico,
tentano di spiegare i fattori determinanti della stabilità termica di
proteine appartenenti ad organismi termofili.
72
Negli ultimi anni essendosi intensificati gli studi su proteine
appartenenti sia ad organismi termofili che ipertermofili, il numero di
sequenze e informazioni strutturali su questa classe di proteine è tale
da aver permesso diversi studi comparativi di tipo statistico su set
piuttosto estesi di dati. In particolare sono stati pubblicati diversi
lavori che si basano sull’esame comparativo tra set di proteine
termofile e set di omologhe mesofile, al fine di individuare i
determinanti strutturali alla base della termostabilità.
I risultati ottenuti hanno rivelato che tra i determinanti strutturali che
conferiscono la termostabilità, un ruolo di primaria importanza
sembra essere svolto dai ponti salini. L’interazione tra coppie ioniche
si ha essenzialmente quando due atomi di carica opposta,
appartenenti a residui amminoacidici carichi ( l’ossigeno del carbonile
di Asp e Glu e l’azoto amminico di Arg, Lys,e Hys) si posizionano
l’uno di fronte all’altro ad una distanza di circa 4 Å.
Gli studi comparativi tra proteine termofile e le omologhe mesofile
descritti in diversi lavori pubblicati, convergono ad uno stesso
risultato: un aumento sensibile di ponti salini tra residui carichi polari
si osserva maggiormente in proteine termofile rispetto alle omologhe
mesofile. Tuttavia tale aumento non è dovuto ad una maggiore
presenza di residui carichi all’interno della sequenza di enzimi
termostabili ma ad una diversa organizzazione strutturale.
É necessario sottolineare che il ruolo dei ponti salini a livello di
stabilizzazione strutturale è ancora oggetto di controversie. In molti
studi infatti i ponti salini determinano la termostabilità ed il confronto
tra proteine termofile e mesofile sembra confermare tale ipotesi. In
altri casi al contrario studi teorici sembrano dimostrare che i ponti
salini destabilizzano lo stato nativo delle proteine. La ragione
principale dell’effetto destabilizzante dei ponti salini sta nel fatto che
la formazione di coppie ioniche all’interno delle proteine ha come
effetto la desolvatazione, che è una conseguenza energeticamente
sfavorevole, in quanto non c’è alcuna compensazione in seguito
all’interazione debole tra residui carichi.
73
Tuttavia, a temperature elevate l’effetto penalizzante della
desolvatazione dei residui carichi in proteine allo stato foldato, è
estremamente ridotto. Dunque i ponti salini nel caso di proteine
termofile hanno un ruolo stabilizzante.
Infine benché tale ipotesi sia confermata da un numero notevole di
analisi comparative, è opportuno ricordare che la maggior parte di
questi studi si basano soltanto sulla struttura delle proteine ed inoltre
non in tutte le proteine termofile analizzate si registra un aumento
del numero di ponti salini rispetto le omologhe mesofile.
Infatti molti altri fattori possono intervenire nel processo di
stabilizzazione termica di proteine termostabili, come ad esempio la
composizione amminoacidica della sequenza, il numero ed il tipo di
legami ad idrogeno per ciascun residuo, l’estensione della regione
idrofobica, le dimensioni e la natura dell’area superficiale accessibile
al solvente, le ridotte dimensioni dei loops che connettono elementi
di struttura secondaria, una maggiore rigidità della struttura
globulare, etc.
L’ effetto di ognuno di questi fattori ed il peso che hanno nei processi
di stabilizzazione termica può variare a seconda del percorso
evolutivo seguito dalle diverse proteine per migliorare la loro
stabilità.
2.4 Conclusioni
Gli studi strutturali condotti sull’enzima SsTrxR(B3) appartenente
all’organismo ipertermofilo Sulfolobus solfataricus, costituiscono il
primo passo compiuto verso la comprensione delle relazione
esistente tra la struttura e la funzione di questa classe di proteine
appartenente al dominio degli archaea.
Gli studi biochimici condotti sull’enzima hanno rivelato proprietà
interessanti.
SsTrxR(B3) possiede due attività enzimatiche ben distinte, l’attività
NADPH-ossidasi e l’attività Tioredossina Reduttasica.
74
L’enzima presenta quindi un’intensa attività catalitica a differenza
delle altre due molecole simili identificate e caratterizzate in
Sulfolobus solfataricus, SsTrxR(B1) e SsTrxR(B2).
Infatti mentre il ruolo biologico di SsTrxR(B2) non è ancora stato
chiarito in quanto gli stessi esperimenti biochimici hanno dimostrato
che l’enzima non è in grado di catalizzare il trasferimento elettronico
dal NADPH al substrato ne tantomeno svolge un attività NADH-
ossidasi, SsTrxR(B1) non può essere classificato come Tioredossina
Reduttasi. Infatti quest’ultima affermazione è dovuta all’assenza del
motivo strutturale CxxC nel sito attivo di SsTrxR(B1), nonostante
l’enzima abbia un attività NADH-ossidasica dipendente dal FAD.
Gli studi strutturali effettuati su SsTrxR(B3) hanno consentito di
fornire alcune elucidazioni per quanto concerne le relazioni struttura-
funzionalità, e struttura-termostabilità di questo enzima.
La determinazione strutturale di SstrxR(B3) costituisce la prima
struttura di TrxR appartenente ad un organismo archaea. L’enzima è
un dimero e ciascun monomero è costituito da due domini, NADH
domain e FAD domain caratterizzati dai motivi di struttura secondari
α-elica e foglietto β.
L’analisi della struttura tridimensionale dell’enzima ha rivelato che
SstrxR(B3) è nello stato FO, ossia nella conformazione adatta per
promuovere l’ossidazione del FAD.
Il dominio contenente il FAD sembra essere più stabile del NADH
domain, ed è stato ipotizzato che possa essere responsabile del
processo di dimerizzazione. L’altro dominio invece sembra svolgere
un ruolo chiave nel processo di stabilizzazione dimerica.
Tuttavia l’assenza di un numero elevato di interazioni forti
all’interfaccia tra i domini sembra spiegare il maggiore disordine del
NADH domain, infatti soltanto un’elevata flessibilità di tale dominio,
così come riscontrato nella Tioredossina Reduttasi appartenete ad
E.coli, può consentire all’enzima di svolgere la propria funzione
biologica.
75
Infatti il passaggio dalla stato FO allo stato FR può avvenire soltanto
in seguito ad una rotazione del NADPH domain rispetto al FAD
domain che attraverso l’avvicinamento del NADPH al FAD puo’
consentire il trasferimento elettronico.
In sostanza, benché SsTrxR(B3) appartenga ad un organismo
ipertermofilo, è una molecola piuttosto flessibile poiché il passaggio
da una conformazione all’altra è il meccanismo alla base del processo
catalitico.
La presenza di interazioni favorevoli all’interfaccia tra i domini,
costituiti essenzialmente da ponti salini, consente l’esplicarsi di tale
meccanismo.
L’analisi della stabilità termica effettuata attraverso la tecnica del
dicroismo circolare ha rivelato altri aspetti interessanti concernenti il
ruolo svolto dai ponti salini all’interno di SsTrxR(B3).
Infatti esperimenti di denaturazione chimica pur confermando
l’elevata stabilità dell’enzima hanno rivelato il ruolo chiave
dell’interazione tra le coppie ioniche, per quanto concerne la
termostabilità. Infatti negli esperimenti descritti nei paragrafi
precedenti, è emerso che l’enzima denatura soltanto in presenza di
un denaturante forte, il cloruro di guanidinio, che generalmente ha
un effetto destabilizzante, interferendo negativamente con le
interazioni elettrostatiche intramolecolari.
76
CAPITOLO 3
DETERMINAZIONE CRISTALLOGRAFICA DI
SsTrxA2
3.1 Introduzione
Le tioredossine costituiscono una classe di proteine molto studiata
per il ruolo fondamentale che svolgono all’interno degli organismi
viventi. Le Trx sono proteine ubiquitarie di piccole dimensioni che
partecipano ad un numero svariato di reazioni di riduzione
nell’ambiente cellulare.
Le Trx vengono considerate le principali fonti di attività disolfuro
reduttasica responsabile del mantenimento dello stato ridotto delle
proteine all’interno della cellula.
Il sistema redox che opera attraverso la Tioredossina (Trx), costituito
dalla Tioredossina stessa, dalla Tioredossina Reduttasi (TrxR), e dal
NADPH, è presente in tutti gli organismi a partire dai batteri fino ad
arrivare all’uomo.
L’attività ditiolo-disolfuro ossidoreduttasica che caratterizza queste
proteine è dovuta essenzialmente alla presenza nel loro sito attivo
del motivo strutturale CXXC, altamente conservato nei vari
organismi.
Queste proteine sono state identificate e caratterizzate
principalmente nei domini eucarya, eubacteria e la sequenza
amminoacidica che circonda il sito attivo sembra altamente
conservata all’interno delle diverse specie.
77
Sono state identificate due forme principali di Trx, denominate in vari
modi, a seconda dell’organismo a cui appartengono. Tuttavia nelle
piante esitono due forme addizionali di tioredossine, identificate
come trxm e trxf entrambe localizzate nel cloroplasto.
Le tioredossine delle diverse specie presentano una percentuale di
identità di sequenza che va dal 27% al 69% rispetto alla
Tioredossina di E.coli dimostrando come tutte le tioredossine
presentino la stessa struttura tridimensionale. Infatti, contengono
tutte il “thioredoxin domain” costituito da un core centrale di cinque
β-foglietti circondati da quattro α-eliche ed, inoltre, risultano
caratterizzate dalla presenza del tetrapeptide –Cys-Gly-Pro-Cys-
dotato di attività redox.
In tutti i casi, le reazioni catalizzate dalla Tioredossina risultano
essere reversibili e portano alla formazione o alla rottura di legami
disolfuro in base al potenziale redox del suo substrato. Ad esempio, il
basso potenziale redox della Tioredossina isolata da E.coli assicura
che la specie Trx-(SH)2 sia il maggiore riducente di ditioli all’interno
del citosol.
Negli ultimi trenta anni gli studi funzionali-strutturali sulle
Tioredossine si sono altamente intensificati, infatti il numero di
strutture tridimensionali risolte di Trx dai diverse organismi è
piuttosto elevato.
Tuttavia mentre gli studi condotti sulle tioredossine da bacteria ed
eucarya sono piuttosto avanzati, si stanno compiendo ancora i primi
passi per quanto riguarda le indagini sperimentali sulle tioredossine
appartenenti al dominio degli archaea.
Sembra infatti che il sistema NADH-Tioredossina Reduttasi all’interno
di tali organismi sia piuttosto complesso.
Attualmente sono in corso studi funzionali-strutturali sulle proteine
ad attività ditiolo-disolfuro appartenenti ad organismi archaea quali
ad esempio Sulfulobus solfataricus e Sulfulobus tokodaii.
oltanto di recente infatti, studi di genomica condotti sull’organismo
ipertermofilo S.solfataricus, hanno rivelato la presenza di diversi geni
78
che codificano per differenti sistemi proteici, Tioredossina-
Tioredossina Reduttasi. In particolare sono state identificate due
tioredossine (SsTrxA1 e SsTrxA2) e tioredossine reduttasi(SsTrxRB2
e SsTrxRB3), oltre che una proteina contenente il motivo strutturale
conservato CXXC, con elevata identità di sequenza con le altre TrxR(
SsTrxRB1).
Inoltre la recente ipotesi che nell’organismo Sulfolobus solfataricus la
proteina disolfuro isomerasi (PDO) potrebbe essere il substrato della
SsTrxR anziché SsTrxA1 e SsTrxA2, rendono lo scenario ancora più
complicato.
Dall’allineamento di sequenza con proteine omologhe è risultato che
SsTrxA2 presenta un’elevata identità di sequenza con la Trx
appartenente all’archeobatterio sulfolobus tokodaii e la Tioredossina,
trxm del cloroplasto da spinacio pari rispettivamente a 90% e 45%.
Al contrario è piuttosto bassa l’identità di sequenza con EcTrx che è
solo del 30%.
Allo scopo di fornire alcuni chiarimenti sulle proprietà degli enzimi
che costituiscono il sistema NADH-Tioredossina Reduttasi
dall’archaeon S.solfataricus, nel presente capitolo verranno presentati
i risultati degli studi funzionali e strutturali condotti sulla Tioredossina
SsTrxA2.
3.1.1 La Tioredossina da E.Coli
La struttura cristallografica della Tioredossina di E. coli è stata risolta
da Katti et al, a 2.8 Å di risoluzione. Dalla struttura cristallografica, è
emerso che il primo residuo di cisteina del sito redox attivo, la Cys
32, risulta essere localizzata vicino al punto in cui ha inizio un motivo
strutturale ad α-elica, ed è localizzata in una regione esposta della
proteina. Il suo pKa di 7.1, molto più basso se confrontato con quello
di una cisteina libera (pKa=8.7, a pH neutro), le conferisce una alta
reattività e risulta essere influenzato dalla vicinanza dell’Asp-26.
Inoltre, sono stati condotti studi NMR sulla struttura tridimensionale
di EcTrx nello stato ridotto e ossidato, ed è stato così dimostrato
79
come la differenza tra le due forme sia davvero sottile, implicando
soltanto un locale cambio conformazionale all’interno ed intorno al
sito attivo.
Riguardo alle modalità con cui possa avvenire la reazione di catalisi,
si ipotizza che, a pH neutro, l’atomo di zolfo reattivo della Cys-32
potrebbe formare un legame a idrogeno con l’atomo di idrogeno del
gruppo SH della Cys-35.
La Cys-32, sotto forma di tiolato, determina un attacco nucleofilo sul
ponte disolfuro della proteina substrato, generando un ponte
disolfuro misto enzima-substrato che viene scisso dalla Cys-35 per
liberare la proteina substrato nello stato ridotto.
Alla fine della reazione, la Tioredossina ossidata viene riportata nella
forma ridotta dalla Tioredossina Reduttasi e dal NADPH.
C’è da sottolineare come, in prossimità del sito attivo, siano presenti
residui aminoacidici idrofobici o non polari quali Gli-33, Pro-34, Ile-
75, Pro-76, Gli-92 e Ala-93, che potrebbero essere importanti per
favorire l’interazione proteina-proteina.
3.1.2 Trxm del cloroplasto da spinacio
L’analisi dei genomi di E.coli, del lievito, di cellule animali e umane,
ha rivelato la presenza di due tipi funzionali di Tioredossina, Trx1,
Trx2. Le piante al contrario contengono due tipi in più di tioredossine
collocate nello stesso comparto cellulare, il cloroplasto, denominate
rispettivamente, trxm e trxf. Contrariamente a quanto riscontrato per
trxm, è risultato che la sequenza di trxf presenta una bassa identità
sia con altre tioredossine che con la stessa trxm.
Nel paragrafo presente vengono esposti i risultati del lavoro di
caratterizzazione strutturale effettuata mediante il metodo
cristallografico, della Tioredossina m, trxm, del cloroplasto da
spinacio.
La struttura nativa cristallografica, in forma ossidata di trxm è stata
determinata a 2.1 Å di risoluzione, mediante il metodo della
80
sostituzione molecolare, utilizzando come modello di partenza la
Tioredossina da E.Coli, EcTrx. La struttura tridimensionale di trxm è
molto simile a quella di EcTrx, infatti l’identità di sequenza tra le due
molecole è pari al 46%.
Lo stato foldato di trxm è quello tipico della tioredossine note, infatti
è caratterizzato da 5 foglietti β sorretti da quattro a-eliche, che
costituiscono il thioredoxin domain. Come le altre tioredossine, trxm
è un agente riducente molto efficiente. La sua attività ditiolo-
disolfuro ossido reduttasi è in gran parte dovuta al suo sito attivo,
che presenta il motivo strutturale altamente conservato
caratterizzato dalla sequenza –Trp-Cys-Gly-Pro-Cys- e alle proprietà
peculiari dei due residui cisteinici. L’efficienza è dovuta in parte al
basso valore del pKa del residuo di cisteina più esposto ( Cys32 in
E.coli trx, Cys37 in Trxm).
Come riscontrato negli studi effettuati sulla EcTrx, il meccanismo alla
base dei processi di riduzione è oggetto di diverse controversie.
Probabilmente sono diversi i fattori che determinano l’attività di tali
proteine, uno di questi è la natura chimica dei residui che si trovano
nelle vicinanze del sito attivo. Un altro importante aspetto che
influisce sulla reattività della tioredossine è l’accessibilità al solvente
della cisteina su menzionata. Per quanto concerne invece il secondo
residuo di cisteina (Cys35 in EcTrx, Cys40 in Trxm), al contrario,
questo si trova collocato in una regione nascosta dove l’accessibilità
al solvente è negata; il pKa di tale residuo è di circa quattro ordini di
grandezza più alto di quello fisiologico, e risulta sostanzialmente un
residuo non reattivo.
Trxm presenta tuttavia un potenziale di riduzione medio molto simile
a quello delle altre tioredossine note.
L’analisi strutturale del sito attivo di trxm ha rivelato che presenta
una geometria molto simile a quello di Ectrx, di conseguenza è stato
possibile ipotizzare che le due molecole abbiano lo stesso
meccanismo di reazione. In seguito a tale ipotesi il meccanismo di
reazione ipotizzato per trxm è quello esposto di seguito.
81
Il residuo di acido aspartico altamente conservato nelle diverse
tioredossine, che corrisponde a Asp26 in EcTrx, Asp31 in trxm,
agisce come accettore di elettroni nel processo di deprotonazione
della cisteina inattiva (Cys 35 in EcTrx, Cys40 in trxm) e rilascia un
protone ad una molecola d’acqua di solvente situata nella vicinanze.
In entrambe le strutture considerate, EcTrx e Trxm, il residuo di
aspartico si trova all’interno di una cavità che ospita una molecola
d’acqua. Alla pari di quanto è stato osservato per EcTrx, anche nel
caso di trxm, il passaggio dalla forma ossidata alla forma ridotta
comporta soltanto una lieve variazione conformazionale.
La sturttura globulare di Trxm è monomerica, tuttavia all’interno del
cristallo sono state individuate due molecole per unità asimmetrica
che non presentano alcuna interazione di natura covalente. Tale dato
sembra essere confermato dagli studi NMR effettuati su tale
molecola.
82
Fig.3.1. Struttura tridimensionale di Trxm del cloroplasto da spinacio
3.2 Materiali e metodi
3.2.1 Preparazione e purificazione di SsTrxA2
Il vettore di espressione pSsTrx-A2 contenente il gene codificante per
SsTrxA2 è stato utilizzato per trasformare ceppi E. coli BL21(DE3),
successivamente fatti crescere a 37°C in Luria-Bertani medium. Dopo
induzione con isopropil-β-D-tiogalattopiranoside (IPTG), le cellule
sono state fatte crescere per circa tre ore. Le cellule batteriche sono
state raccolte tramite centrifugazione a 3000*g per 15 minuti a 4 °C
e risospese in 20 ml di un tampone contenente 20mM Tris-HCl pH
7.8, 5mM MgCl2, 50mM KCle 1 mM PMSF. La rottura delle cellule è
stata effettuata tramite un sistema di rottura cellulare meccanica.
L'omogenato cellulare é stato centrifugato a 100,00*g per circa due
83
ore ed il sovranatante post-ribosomale ottenuto é stato sottoposto
per 30 min ad un temperatura di 70°C. Dopo aver allontanato
mediante centrifugazione le proteine di E.coli, denaturate dal
trattamento termico, il supernatante è stato dializzato in un tampone
contenente 25mM Mes/KOH, pH 5.5. Successivamente il campione è
stato caricato su una colonna mono S a scambio cationico collegata
ad un sistema FPLC operante a temperatura ambiente. L’eluizione è
stata condotta mediante un gradiente di KCl (0-200mM). L’eluizione
di SstrxA2 è avvenuta ad una concentrazione di KCl pari a 25mM. Le
frazioni che mostravano la presenza di un'unica banda
elettroforetica, su gel di poliacrilammide in condizioni denaturanti
(SDS-PAGE; Laemmli, 1970), sono state riunite e concentrante
mediante Aquacide II. Dopo essere stato dializzato in un tampone
contenente 20 mM il campione è stato conservato a -20°C. In queste
condizioni l'attività si è mantenuta per diversi mesi. La proteina
presentava un peso molecolare di 15 kDa, tuttavia effettuando la
purificazione in essenza di PMSF è stata ottenuta la forma troncata di
SsTrxA2, dal peso molecolare di circa 12 kDa, corrispondente al
Thioredoxin domain.
3.2.2 Attività enzimatica di SsTrxA2
Gli esperimenti di determinazione dell’attività enzimatica di SsTrxA2
sono stati condotti presso i laboratori del Dipartimento di Biochimica
e Biotecnologie Mediche di Napoli. L’attività tioredossinica è stata
determinata tramite il metodo turbidimetrico di riduzione
dell’insulina, utilizzando come donatori di riducenti equivalenti, sia
DTT che il complesso NADH-Tioredossina Reduttasi. La velocità
iniziale della reazione di riduzione è stata dedotta dalla parte lineare
della curva di assorbanza misurata a 650nm nell‘intervallo 0,1-0,4.
84
3.2.3 Determinazione del potenziale redox di riduzione
Il potenziale redox del sistema Tioredossina-NADH-Tioredossina
Reduttasi è stato determinato a 60 °C misurando la variazione del
segnale di assorbanza a 340nm. Per effettuare tale esperimenti 10-
36µM di SsTrxA2 sono stati miscelati con 50 µM di NADPH portando
la miscela ad un volume finale di 1ml in un tampone contenente
25mM di MES/KOH e 2mM EDTA, pH 5.5. La reazione è iniziata in
seguito all’aggiunta di 2 µM di SsTrxR-B3. Quando il segnale di
assorbanza si è stabilizzato intorno un valore basso, è stato aggiunto
alla miscela di reazione un eccesso di NADP+ (1200 µM), e la
reazione è stata monitorata fino a quando il segnale di assorbanza ha
raggiunto un livello alto mantenendosi costante a 340nm. Il
potenziale di riduzione è stato calcolato dall’equazione di Nernst a
partire dai valori di concentrazione delle specie ridotte ed ossidate sia
della tioredossine che delle specie elettron-donatore. Per la
risoluzione dell’equazione è stato inoltre utilizzato come valore di
potenziale di riduzione del NADP+, quello calcolato a pH 5.5, risultato
pari a -271 mV. Il potenziale di riduzione riportato costituisce il valore
medio calcolato su 3-4 determinazioni e la varianza dei valori
misurati in ogni singola determinazione non ha superato il 4%.
3.2.4 Misura della termofilicità
Un campione contenente 50 µM SsTrxA2 in un tampone costituito da
100mM di fosfato di potassio, 2 mM di EDTA, pH 7.0, è stato
sottoposto a differenti temperature. A intervelli di tempo prestabiliti,
è stata misurata l’attività enzimatica residua utilizzando il metodo di
riduzione dell’insulina in presenza di DTT come specie elettron-
donatore. A partire dall’equazione At/Ao=-kT, è stata calcolata la
costante cinetica alla temperatura di inattivazione termica. Ao
rappresenta l’attività del campione che non ha subito trattamento
85
termico, At è l’attivtà misurata al tempo T di trattamento termico e K
è la costante cinetica del processo di inattivazione termica. L’energia
di attivazione del processo di inattivazione termica è stata calcolata
dalla curva di Arrhenius ottenuta riportando il logaritmo naturale
della costante cinetica in funzione della temperatura.
3.2.5 Cristallizzazione di SsTrxA2
La trattazione teorica della cristallizzazione di proteine è riportata in
dettaglio nell’Appendice I. Di seguito sono descritte brevemente le
condizioni di cristallizzazione di SsTrxA2 ricombinante ottenuto
attraverso la procedura appena descritta. Gli esperimenti di
cristallizzazione sono stati condotti a 293K usando i metodi di
cristallizzazione del microbath sott’olio e della diffusione in fase
vapore, hanging drop. Prove preliminari di cristallizzazione sono state
effettuate utilizzando un KIT reperibile in commercio contenente
soluzioni precipitanti a matrice sparsa (Crystal screen kits I and II,
Hampton Research).
Cristalli singoli adatti per una analisi cristallografica, sono stati
ottenuti dalla sola forma troncata di SsTrxA2, thioredoxin domain,
utilizzando un intervallo di concentrazione di proteina compreso tra
4-9 mg ml-1 e una soluzione precipitante contenente PEG3350 18-
22% (w/v), 0.2 M (NH4)I (fig.1(a)). Nelle Figure 3.2 e 3.3 sono
riportate le immagine dei cristalli ottenuti nelle condizioni di
cristallizzazione sopradescritte
86
Fig.3.2. Cristalli di SsTrxA2, forma troncata, Thioredoxin domain
Fig.3.3. Cristalli di SsTrxA2, forma intatta, full lenght
3.2.6 Registrazione ed analisi statistica dei dati cristallografici di SsTrxA2
Dati di diffrazione sono stati registrati in house a 298 K, utilizzando
un CCD Saturn 944 collegato ad un generatore di radiazioni CuKα
87
MicroMax 007HF(RIGAKU) di lunghezza d’onda pari a 1.5418 Å. I
cristalli sono stati congelati aggiungendo alla soluzione tampone di
cristallizzazione, glicerolo al 22% (v/v), per evitare processi di
decadimento del cristallo. I dati di diffrazione sono stati raccolti a
1.83 Å e processati mediante l’utilizzo del programma HKL2000.
Fig.3.4. Pattern di diffrazione di SsTrxA2 (thioredoxin domain)
Fig.3.5. Analisi statistica dei dati cristallografici di SsTrxA2 (thioredoxin domain)
88
3.2.7 Risoluzione ed affinamento cristallografico di SsTrxA2
La struttura tridimensionale di SsTrxA2 è stata risolta utilizzando
come modello di partenza la struttura della Tioredossina m del
cloroplasto da spinacio (trxm), che presenta un indentità di sequenza
del 45%. Il programma ARP/wARP(Perrakis et al., 1999) è stato in
grado di tracciare automaticamente la maggior parte della struttura
di SsTrxA2 (tioredoxin domain). L’affinamento cristallografico è stato
effettuate mediante il programma CNS.
3.2.8 Determinazione della stabilità di SsTrxA2 mediante la tecnica spettroscopica del Dicroismo
circolare
La concentrazione delle proteine è stata determinata misurando
l’assorbanza a 280 nm, mediante uno spettrofotometro Jasco J-550.
Tutte le misure spettroscopiche sono state registrate con uno
spettropolarimetro Jasco J-810 provvisto di un sistema Peltier per il
monitoraggio della temperatura (modello PTC-423-S). Le curve di
denaturazione indotte da urea e da GuHCl, a temperatura costante,
sono state ottenute registrando la variazione del segnale CD a 222
nm a 20°C. La curva di denaturazione termica è stata registrata
misurando la variazione del segnale CD nell’intervallo 40-105°C a
λ=200 nm e a λ=222 nm con una velocità di scansione di 1.0°C min-
1.
89
3.2.9 Esperimenti di denaturazione chimica
Entrambi i denaturanti urea e guanidinio idrocloruro (GuHCl) sono
stati acquistati come prodotti ultrapuri dalla ditta Sigma: il cloruro di
guanidinio come soluzione acquosa 8 M, mentre l’urea come solido.
Le soluzioni di urea sono state preparate solubilizzando una quantità
nota nella soluzione tampone, dopo aver essiccato il solido per circa
due ore sotto vuoto su P2O5. Le concentrazioni delle soluzioni sono
state determinate attraverso le misure degli indici di rifrazione (Pace
1986). E’ stato necessario preparare le soluzioni di urea al momento
dell’uso a causa dei fenomeni di decomposizione in ammonio e
cianato. Infatti, già dopo una settimana dalla preparazione della
soluzione lo ione cianato è presente in concentrazioni apprezzabili e
può modificare i gruppi amminici della proteina. Per la costruzione di
ogni curva di denaturazione sono state preparate e analizzate diverse
soluzioni con una concentrazione di proteina costante e una
concentrazione crescente di denaturante, compresa tra 0.0 e 9.6 M
di urea o tra 0.0 e 7.0 M di cloruro di guanidinio. In particolare, a 10-
20 µL della soluzione madre di proteina sono stati aggiunti l’agente
denaturante, quindi il tampone fosfato fino al volume finale di 500
µL. Siccome elevate concentrazioni di urea e di cloruro di guanidinio
fanno variare il pH, per ogni singolo campione il pH è stato corretto
aggiungendo opportune quantità di soluzioni concentrate di HCl
oppure di NaOH. Inoltre i campioni sono stati miscelati e incubati per
una notte a 4 °C. Un’incubazione più lunga produce segnali CD e di
fluorescenza sovrapponibili.
3.2.10 Analisi della struttura secondaria
Per indagare sugli aspetti molecolari che conferiscono la particolare
stabilità di proteine appartenenti ad organismi estremofili sono stati
fatti allineamenti di sequenza mediante il programma BLAST per
90
valutare eventuali delezioni o inserzioni di residui amminoacidi che
possono determinare cambiamenti nella struttura secondaria. In
particolare la sequenza amminoacidica di SsTrxA2 è stata confrontata
con quella di tioredossine da organismi mesofili e sono state valutate
nel particolare le differenze tra le sequenze di SsTrxA2, trxm, EcTrx.
91
3.3 Risultati
3.3.1 Proprietà biochimiche di SsTrxA2
La forma intatta di SsTrxA2 purificata, come determinato dalla banda
presente su gel SDS, presenta un peso molecolare di 15 kDa (forma
full lenght). Tuttavia esperimenti di purificazione effettuati
omettendo l’aggiunta di PMSF hanno consentito l’ottenimento
soltanto della forma troncata di SsTrxA2, caratterizzata dal solo
thioredoxin domain. Questo dato è stato ulteriormente confermato
da successivi esperimenti di spettrometria di massa a cui sono state
sottoposte entrambe le forme ottenute.
I risultati di questi esperimenti hanno dimostrato che la forma intatta
di SsTrxA2 presenta una massa molecolare di 15517 Da, un valore
coincidente con quello deducibile dalla sequenza amminoacidica
(15518 Da).
La forma troncata di SstrxA2 invece presenta un peso molecolare di
12522 Da coincidente con la regione compresa tra i residui Lys26-
Glu135.
La massa molecolare determinata attraverso cromatografia a
scambio ionico, effettuata per la forma troncata di SsTrxA2,
mediante una colonna Superdex 75, ha invece rivelato un peso
molecolare pari a 24 kDa. Il metodo cromatografico è stato applicato
in presenza dell’agente riducente β-mercaptoetanolo. Questo dato
confrontato con quanto rilevato per le proteine mesofile, che
sottoposte allo stesso esperimento, presentavano un peso
molecolare nettamente inferiore, indica che SsTrxA2 (thioredoxin
domain) è un omodimero e il legame covalente tra i due monomeri
non è costituito dal ponte disolfuro.
92
L’attività di SsTrxA2 è stata valutata tramite il metodo nefelometrico
valutando la riduzione di insulina in presenza o del DTT o della
Tioredossina Reduttasi.
SstrxA2 è in grado di trasferire elettroni dal DTT all’insulina
determinando la sua riduzione seguita dalla conseguente
precipitazione. Il tempo in cui ha inizio la reazioni dipende
direttamente dal pH. Per una concentrazione di SsTrxA2 pari a 10µM
la riduzione dell’insulina ha inizio a 2.2 min e 3.9 min per valori di pH
pari 7.0 e 5.5. La stessa reazione è stata seguita in presenza di
SsTrxR(B3), e NADPH come elettron donatore. In questo caso
SsTrxA2 ha catalizzato la reazioni di trasferimento elettronico dal
NADPH all’insulina, ma la velocità d’inizio reazione è risultata più alta
rispetto a quella registrata in presenza del DTT. In presenza di DTT è
stato osservato che il massimo di attività di SsTrxA2 si registra a pH
7, mentre in presenza di SsTrxR(B3) e NADPH, la massima efficienza
catalitica si svolge a pH acido, 5.5. Inoltre gli stessi esperimenti
condotti utilizzando la specie troncata di SstrxA2 (thioredoxin
domain), hanno rivelato che nonostante abbia la stessa attività
reduttasica della forma intatta, presenta un’attività ossidante
leggermente inferiore. Ad ogni modo gli esperimenti condotti per
misurare il potenziale di riduzione oltre a dimostrare che il
trasferimento elettronico tra SsTrxA2 e SsTrxR(B3) è altamente
reversibile, confermano l’appartenenza di SsTrxA2 al sistema NADH-
Tioredossina Reduttasi.
3.3.2 Il potenziale redox di SsTrxA2
Il trasferimento elettronico tra la Tioredossina e la Tioredossina
Reduttasi è un processo altamente reversibile. Tale osservazione
infatti è stata dimostrata aggiungendo alla miscela di reazione,
descritta nella sezione materiali e metodi, un eccesso di NADP+,
successivamente alla completa ossidazione del NADPH catalizzata
dalla Tioredossina Reduttasi SsTrxR(B3) a T=60° e pH 5.5. Con
93
questa procedura è stato possibile calcolare il potenziale di riduzione
dall’equazione di Nernst all’equilibrio. I valori del potenziale di
riduzione determinati per la forma intatta e la forma troncata di
SsTrxA2 sono risultati leggermente diversi, pari rispettivamente a -
168 mV e -175 mM.
3.3.3 Inattivazione termica di SsTrxA2
L’inattivazione termica di SsTrxA2 è stata valutata misurando l’attività
residua di riduzione dell’insulina mediante DTT, dopo aver esposto la
proteina purificata a diverse temperature. I risultati di tali
esperimenti hanno confermato che SsTrxA2 è un proteina molto
stabile, infatti una perdita significativa dell’attività enzimatica è stata
riscontrata soltanto dopo aver esposto l’enzima a trattamento
termico per diverse ore, in un intervallo di temperatura compreso tra
92 e 99°C. É’ stato successivamente osservato, effettuando gli stessi
esperimenti sulla Tioredossina SsTrxA1, che SsTrxA2 è leggermente
più stabile di SsTrxA1, infatti a 92°C la due temperature medie di
inattivazione termica risultano pari a 20.5 h e 56.6 h rispettivamente.
Il processo d’inattivazione dal punto di vista cinetico può essere
descritto da un equazione di primo ordine. Tale risultato ha
consentito l’analisi dei dati attraverso l’utilizzo dell’equazione di
Arrhenius. Dalla retta di Arrhenius è stato infatti possibile
determinare l’energia di attivazione del processo che per SsTrxA2 è
risultata pari a 292 KJ/mol.
3.3.4 Determinazione della struttura cristallografica di SsTrxA2
Prove di cristallizzazione preliminari, effettuate su SsTrxA2 utilizzando
kit disponibili in commercio, hanno rivelato che esistono diverse
condizioni chimico-fisiche che determinano la formazione di cristalli di
94
SsTrxA2. In particolare tutti gli esperimenti che hanno mostrato un
apparente successo avevano un elemento in comune: la presenza del
polietilenglicole (PEG) come agente precipitante. Tuttavia in tutti casi
in cui sono stati ottenuti cristalli si è tentato di migliorare la qualità
degli stessi variando leggermente le concentrazioni della proteina e
dell’agente precipitante rispetto alle condizioni iniziali. Le prove di
cristallizzazione sono state effettuate su entrambe le forme purificate
di SsTrxA2, la forma intatta (full lenght) e la forma troncata
(thioredoxin domain). Tuttavia soltanto i cristalli ottenuti a partire
dalla forma troncata sono risultati quelli adatti per un analisi
cristallografica. I cristalli di SsTrxA2 (thioredoxin domain) si sono
formati da una soluzione contenente 18-22%(w/v) di PEG3350 e 0.2
M di NH4I. La concentrazione di proteina era nell’intervallo 4-9mg ml-
1. In tre giorni i cristalli hanno raggiunto le dimensioni finali di
0.05×0.05×0.5mm3.
I dati diffrazione sono stati raccolti a 1.83 Å di risoluzione utilizzando
una sorgente convenzionale di radiazioni X. Dal calcolo del
coefficiente di Matthews è risultata la presenza di un singolo
omodimero di SsTrxA2 all’interno dell’unità asimmetrica (Vm=1.95 Å3
Da-1; il contenuto di solvente pari al 37%). Le stesse condizioni di
cristallizzazioni effettuate utilizzando SsTrxA2 (full lenght) hanno
consentito la formazione di cristalli non singoli della forma intatta,
ma i tentativi di migliorare la loro qualità hanno avuto come esito un
insuccesso. Tale risultato ha avvalorato l’ipotesi che la presenza del
frammento N-terminale, che presenta di norma uno stato non
foldato, ha un impatto negativo sul processo di crescita di cristalli
ordinati. La struttura tridimensionale di SsTrxA2 (forma troncata) è
stata risolta con il metodo della sostituzione molecolare, utilizzando
come modello di partenza la struttura della Tioredossina m del
cloroplasto da spinacio (trxm), che presenta un’indentità di sequenza
del 45%. Il programma ARP/wARP (Perrakis et al., 1999) è stato in
grado di tracciare automaticamente la maggior parte della struttura
di SsTrxA2 (tioredoxin domain). L’affinamento cristallografico è stato
95
effettuato mediante il programma CNS. Il cristallo di SsTrxA2
appartiene al gruppo spaziale P2 e la presenza di un dimero
all’interno dell’unità asimmetrica è in disaccordo con quanto rivelato
per strutture note di altre tioredossine. Dall’ osservazione della
densità elettronica è emerso che in prossimità del sito attivo
dell’enzima, costituito dal motivo strutturale altamente conservato
nelle diverse tioredossine, Cys-Ala-Pro-Cys, è chiaramente visibile il
ponte disolfuro tra i due residui cisteinici.
Fig.3.6. Struttura tridimensionale del monomero di SsTrxA2 (thioredoxin domain)
3.3.5 Descrizione della struttura complessiva di SsTrxA2
La struttura tridimensionale di SsTrxA2 presenta alcune delle
caratteristiche tipiche delle tioredossine a struttura nota, isolate e
caratterizzate nei diversi organismi. Si tratta tuttavia della prima
96
struttura risolta di Tioredossina appartenente ad un organismo
estremofilo. L’enzima essendo in forma troncata mostra i motivi di
struttura secondaria tipici del thioredoxin domain. Infatti la molecola
è costituita essenzialmente da quattro α-eliche, e cinque foglietti β
disposti in modo tale da formare una struttura globale piuttosto
compatta. La regione N-terminale essendo non strutturata e
possedendo un elevata flessibilità, è delineata correttamente nella
mappa di densità elettronica, soltanto a partire dal residuo di valina
34. La regione C-terminale allo stesso modo è stata identificata fino
al residuo di leucina 134. La struttura cristallina di SsTrxA2 è in
forma ossidata, infatti è chiaramente visibile la densità elettronica
che descrive il ponte disolfuro formato dai residui di cisteina che
costituiscono il sito attivo.
La struttura globulare di SsTrxA2 è un omodimero, tuttavia se
confrontata con altre tioredossine in forma dimerica, non presenta le
stesse interazioni.
Fig.3.7. Omodimero di SsTrxA2
97
3.3.6 Descrizione del sito attivo
Il sito attivo di SsTrxA2 è costituito dal motivo strutturale altamente
conservato dato dalla sequenza Cys-Ala-Pro-CYs. Il gruppo cisteinico
nucleofilo e quello invece nascosto al solvente corrispondono ai
residui numero 60 e 63 lungo la sequenza di SsTrxA2. La mappa di
densità elettronica delinea chiaramente il ponte disolfuro formato dai
due residui.
Il sito attivo è localizzato sulla superficie di un loop ubicato nella zona
terminale dello strand β2 che precede una lunga α-elica. In accordo
a quanto riscontrato nella sequenza di altre tioredossine appartenenti
ai diversi organismi, nelle vicinanze del sito attivo sono localizzati
diversi residui carichi che potrebbero svolgere un ruolo chiave sia nel
meccanismo di reazione sia nel determinare le differenti proprietà
delle tioredossine.
In particolare, il residuo di aspartico in posizione 56, che risulta
ampiamente conservato, sembra avere un ruolo fondamentale nei
processi ossido-riduttivi che coinvolgono le tioredossine
3.3.7 Confronto della struttura di SsTrxA2 e EcTrx, Trxm
Dalle sovrapposizioni della catena principale di SstrxA2-Trxm e
SstTrxA2-e.coliTrx, effettuate mediante l’utilizzo del programma di
grafica molecolare O, è emerso che nonostante i motivi di struttura
secondaria che costituiscono il thioreoxin domain siano
sostanzialmente gli stessi, in corrispondenza di alcune tratti della
catena la sovrapposizione non è ottimale. In particolare la
sovrapposizione di SsTrxA2 e EcTrx ha rivelato che la struttura di
SsTrxA2 è molto più compatta, infatti l’enzima ha una conformazione
meglio strutturata a causa di una maggiore estensione dei motivi di
struttura secondaria. La sovrapposizione tra SsTrxA2 e Trxm ha
98
determinato valori accettabili della deviazione quadratica media solo
in corrispondenza di alcuni tratti della catena. Le eliche α2 e α3 e i
foglietti β1 e β3 presentano le stesse dimensioni e sono
sostanzialmente conservati, al contrario le differenze sostanziali sono
in corrispondenza delle regioni occupate dai loops. In particolare in
SsTrxA2 è assente il loop che collega in motivi strutturali α1 e β2,
mentre il loop che connette l’elica α2 e il foglietto β3 è più corto.
Anche in questo caso la struttura di SsTrxA2 rispetto a quella di trxm
risulta essere più strutturata e maggiormente compatta.
3.3.8 Analisi del contenuto di struttura secondaria
Lo spettro CD di SsTrxA2 misurato nel lontano UV mostra
chiaramente che l’enzima è dotato degli elementi di struttura
secondaria α-elica e β-sheet. Infatti il massimo a 195 mn ed il
minimo a 222 nm sono caratteristici di una struttura di tipo αβ.
3.3.9 Analisi della stabilità termica
La stabilità termica di SsTrxA2 è stata analizzata mediante lo studio
delle variazioni dello spettro CD a λ=200 nm e λ=222 nm
nell’intervallo 40-105°C. Queste due lunghezze d’onda sono scelte
per ottenere informazioni sull’effetto della temperatura sia sulle
regioni ad α-elica ([θ]220) che β-sheet ([θ]200) della proteina. In
queste condizioni, il processo di denaturazione termica non provoca
alcuna variazione conformazionale, in quanto la proteina mantiene il
suo stato foldato anche se sottoposta per diverse ore a temperature
superiori ai 105°C. Questa osservazione sperimentale conferma
l’elevata termostabilità di SsTrxA2.
99
Fig.3.8. Caratterizzazione spettroscopica di SsTrxA2: spettro CD lontano UV.
3.3.10 Denaturazione chimica
Per valutare ulteriormente la stabilità confomazionale di SsTrxA2,
sono stati effettuati esperimenti di denaturazione chimica utilizzando
due diversi agenti denaturanti, GuHCl e urea. In particolare sono
stati registrati gli spettri CD di SsTrxA2 a temperature ambiente per
miscele diverse proteine-agente denaturante (urea e cloruro di
guanidinio) a concentrazione variabile (2-8 M). L’analisi degli spettri
CD ha rivelato che, in presenza dell’ urea, l’enzima conserva la sua
stabilità anche per concentrazioni di agente denaturante superiori a 8
M. In presenza di GuHCl, l’enzima comincia a perdere il suo stato
foldato a per valori di concentrazione di GuHCL superiori a 4 M. Il
dato conferma ulteriormente l’elevata termostabilità dell’enzima che
è infatti in grado di mantenere il suo stato foldato anche in presenza
di concentrazioni discrete di un agente denaturante forte.
L’esperimento sembra dimostrare che la termostabilità dell’enzima,
non sia dovuta alla presenza dei ponti salini come invece è stato
riscontrato nel caso di SsTrxA2. Infatti poiché il numero di ponti salini
190 200 210 220 230 240 250-15
-10
-5
0
5
10
15
20
[ϑ] (
deg
cm2 dm
ol-1)1
0-3
Wavelenght (nm)
100
presenti nella struttura di SsTrxA2 è piuttosto basso si pensa che la
termostabilità sia dovuta ad altri determinanti strutturali.
Fig.3.9. Spettro CD registrato nel lontano UV della proteina nativa trattata con soluzioni
diversamente concentrate di cloruro di guanidinio (GuHCl)
3.3.11 Stabilità termica
Negli ultimi anni gli studi avviati per indagare su quali siano le
caratteristiche della sequenza e i fattori strutturali che determinano
la termostabilità di proteine da organismi termofili ed ipertermofili,
sembrano dimostrare che in taluni casi un aumento della rigidità
conformazionale di queste proteine rispetto alle loro omologhe sia
uno dei tanti sistemi escogitati per l’adattamento alla alte
temperature. In molti casi tale rigidità è dovuta all’assenza di loop
nella zona superficiale della molecola e/o una riduzione della loro
estensione, che conseguentemente ad un aumento dei motivi di
struttura secondaria, conferiscono una maggiore strutturazione. I
risultati ottenuti dagli studi strutturali condotti su SsTrxA2, sembrano
190 200 210 220 230 240 250-15
-10
-5
0
5
10
15
20
[ϑ] (
deg
cm2 dmol-1
)10-3
Wavelenght (nm)
GuHCl 0M GuHCl 5MGuHCl 6MGuHCl 7M
190 200 210 220 230 240 250-15
-10
-5
0
5
10
15
20
190 200 210 220 230 240 250-15
-10
-5
0
5
10
15
20
[ϑ] (
deg
cm2 dmol-1
)10-3
Wavelenght (nm)
GuHCl 0M GuHCl 5MGuHCl 6MGuHCl 7M
101
essere in linea con tale ipotesi, in quanto la ridotta dimensione dei
loops rispetto alle omologhe mesofile si può annoverare come uno
dei fattori che conferiscono l’elevata stabilità. Tale ipotesi sembra
trovare conferma da alcuni studi comparativi effettuati tra SsTrxA2 e
la Tioredossina estratta da un organismo ipertermofilo che vive in
giappone, Sulfolobus tokodaii che presentano un identità di sequenza
pari a circa al 90%. Nella fase terminale del presente progetto
essendo stata pubblicata la struttura cristallografica di un mutante di
StTrx, K53E, (Ming H. et al 2007) sono stati fatti degli studi per
rilevare le differenze e similitudini che le due proteine presentano a
livello strutturale. La determinazione della struttura cristallografica di
StTrxK53E (Val37-Glu154), mostra che l’enzima presenta il solo
tioredoxin domain tipico delle tioredossine , caratterizzato dai motivi
strutturali α/β. Tuttavia l’enzima sembra avere un numero molto
elevato di ponti salini rispetto alle omologhe mesofile, collocati
essenzialmente nella zona superficiale della molecola. In particolare i
ponti salini individuati sono cinque e sembra che entrambi siano
responsabili dell’elevata stabilità dell’enzima. Al contrario nonostante
SsTrxA2 e StTrxK53E abbiano un numero notevole di similitudini a
livello di struttura secondaria e terziaria, alcuni dei ponti salini
identificati in StTrxK53E non sono stati riscontrati in SsTrxA2, oppure
se presenti non mostrano una geometria perfettamente corretta.
Questo dato sembra condurre nuovamente all’ipotesi precedente, gli
enzimi termostabili escogitano diverse strategie per conservare la
loro stabilità, e nel presente esempio sembra emergere che
nonostante le due proteine ipertermofile siano molto simili usano
sistemi differenti per conservare la loro integrità strutturale a
temperature elevate.
3.4 Conclusioni
SsTrxA2 risulta essere un enzima piuttosto interessante non soltanto
per le sue proprietà biochimiche ma anche per le proprietà
102
strutturali. Dai risultati sperimentali presentati nel presente capitolo è
stato confermato che l’enzima è il substrato di SsTrxR(B3) quindi
prende parte al meccanismo redox NADPH-Tioredossina Reduttasi.
SsTrxA2, presenta le caratteristiche di base tipiche della tioredossine
note, è infatti una proteina ubiquitaria a basso peso molecolare di
15517Da, costituita dal tioredoxin domain ed un estensione N-
terminale dotata di una certa flessibilità. Tale dato trova evidenza
sperimentale nel fatto che sono stati ottenuti cristalli adatti per un
analisi cristallografica, soltanto per quanto concerne la forma
tronacata di SsTrxA2 (thioredoxin domain). Evidentemente il
frammento mancante non essendo strutturato, quindi maggiormente
flessibile, interferisce con il processo di formazione di cristalli
ordinati.
Per quanto concerne la struttura quaternaria, a differenza di quanto
riscontrato per le altre tioredossine, SsTrxA2 è un omodimero. Sono
state avanzate diverse ipotesi per spiegare il significato strutturale-
funzionale della dimerizzazione. Ad esempio nella Tioredossina
umana, la dimerizzazione è necessaria per la regolazione della
funzione biologica. Nell’organismo termofilo, Thermus thermophilus,
invece la formazione del dimero è importante per l’attività
enzimatica.
Lo stato dimerico di SsTrxA2 potrebbe avvalorare la recente ipotesi
che il reale substrato di SsTrxR(B3) sia la proteina PDO anziché Trx,
poiché tale conformazione potrebbe rendere difficile l’interazione
TrxR-Trx. Tuttavia i dati biochimici hanno dimostrato che SsTrxR(B3)
riduce SsTrxA2 per cui il dibattito resta ancora aperto.
SsTrxA2 si caratterizza inoltre per la sua elevata termostabilità, infatti
è capace di conservare la propria attività enzimatica anche a
temperature al di sopra dei 90°C. Dal confronto con la struttura di
Trx da Sulfolobus tokodaii, che presenta un’identità di sequenza pari
al 90%, il cui lavoro di cristallizzazione è stato pubblicato nella fase
terminale di questi studi, è emerso che nonostante i due enzimi
presentano un’elevata similitudine a livello di struttura secondaria e
103
terziaria, i determinanti strutturali della termostabilità non sembrano
essere gli stessi.
Infatti in StTrx sono stati individuati 5 ponti salini considerati come i
motivi chiave dell’elevata stabilità dell’enzima. Al contrario la maggior
parte di queste interazioni non sono conservate in SsTrxA2, o se
presenti non si dispongono in una geometria corretta. In base a tale
riscontro sembra quindi che la termostabilità di SsTrxA2 non possa
spiegarsi come dovuta alla presenza dei ponti salini ma piuttosto è
attribuibile ad una maggiore strutturazione, dovuta all’aumento dei
motivi di struttura secondaria, alla riduzione o assenza di alcuni loops
rispetto alle proteine con cui è stata messa a confronto.
104
CAPITOLO 4
DETERMINAZIONE CRISTALLOGRAFICA DI
SsTrxA1
4.1 Introduzione
L’analisi del genoma di S.solfataricus ha rivelato che il sitema redox
NADH-reduttasico di questo organismo è piuttosto complesso. Infatti
successivamente alla caratterizzazione della Tioredossina Reduttasi,
SsTrxR(B3), sono stati espressi altri geni codificani per una seconda
Tioredossina Reduttasi SsTrxR(B2) e due tioredossine SsTrxA2,
SsTrxA1. Entrambi i geni sono stati clonati attraverso un vettore
procariota e successivamente sono state caratterizzate le proteine
purificate. SsTrxR(B2), a differenza di SsTrxR(B3) che presenta due
funzioni, non possiede attività Tioredossina-reduttasica. Sembra
quindi che SsTrxR(B3), al di là dell’apparente ridondanza all’interno
del sistema, abbia due differenti substrati SsTrxA2, SsTrxA1.
I due enzimi, SsTrxA2, SsTrxA1, sono piuttosto differenti, infatti
presentano un’identità di sequenza pari a circa il 40%. Tuttavia si
distinguono non soltanto per le loro proprietà strutturali, ma anche
per quanto concerne la loro attività biologica e termostabilità. Infatti
SsTrxA2 è leggermente più attiva e stabile di SsTrxA1. Nel presente
capitolo verranno presentati i risultati degli studi cristallografici
condotti su SsTrxA1, avviati essenzialmente per capire il ruolo di tale
enzima all’interno del sistema redox di Sulfolous solfataricus, e per
valutare se la proteina abbia escogitato una strategia differente o
105
simile rispetto a SstrxR(B3) e SsTrxA2, per adattarsi all’estreme
temperature.
4.2 Materiali e metodi
4.2.1 Preparazione e purificazione di SsTrxA1
La preparazione della forma ricombinante della Tioredossina, TrxA1,
da S.solfataricus, è piuttosto simile alla procedura utilizzata nel caso
di SsTrxA2. Il vettore di espressione pSsTrx-A1 contenente il gene
codificante per SsTrxA1 è stato utilizzato per trasformare ceppi E.coli
BL21(DE3), successivamente fatti crescere a 37°C in Luria-Bertani
medium. Dopo induzione con isopropil-β-D-tiogalattopiranoside
(IPTG), le cellule sono state fatte crescere per circa tre ore. Le cellule
batteriche sono state raccolte tramite centrifugazione a 3000*g per
15 minuti a 4 °C e risospese in 20 ml di un tampone contenente
20mM Tris-HCl pH 7.8, 5mM MgCl2, 50mM KCl e 1 mM PMSF. La
rottura delle cellule è stata effettuata tramite un sistema di rottura
cellulare meccanica. L'omogenato cellulare é stato centrifugato a
100,00*g per circa due ore ed il sovranatante post-ribosomale
ottenuto é stato sottoposto per 30 min ad un temperatura di 70°C.
Dopo aver allontanato mediante centrifugazione le proteine di E. coli,
denaturate dal trattamento termico, il supernatante è stato dializzato
in un tampone contenenente 25mM Mes/KOH, pH 5.5.
Successivamente il campione è stato caricato su una colonna mono S
a scambio cationico collegata ad un sistema FPLC operante a
temperatura ambiente. L’eluizione è stata condotta mediante un
gradiente di KCl (0-200mM). L’eluizone di SstrxA1 è avvenuta ad una
concentrazione di KCl pari a 60mM. Le frazioni che mostravano la
presenza di un'unica banda elettroforetica, su gel di poliacrilammide
in condizioni denaturanti (SDS-PAGE; Laemmli, 1970), sono state
riunite e concentrante mediante Aquacide II. Dopo essere stato
dializzato in un tampone contenente 20 mM a -20°C. In queste
condizioni l'attività si è mantenuta per diversi mesi. La proteina
106
presentava un peso molecolare di 15kDa, tuttavia effettuando la
purificazione in essenza di PMSF è stata ottenuta la forma troncata di
SsTrxA1, dal peso molecolare di circa 12 kDa, corrispondente al
Thioredoxin domain.
4.2.2 Attività enzimatica di SsTrxA1
Gli esperimenti di determinazione dell’attività enzimatica di SsTrxA1
sono stati condotti presso i laboratori del Dipartimento di Biochimica
e Biotecnologie Mediche di Napoli. L’attività tioredossinica è stata
determinata tramite il metodo di turbidimetrico di riduzione
dell’insulina, utilizzando come donatori di riducenti equivalenti, sia
DTT che il complesso NADH-Tioredossina Reduttasi. La velocità
iniziale della reazione di riduzione è stata dedotta dalla parte lineare
della curva di assorbanza misurata a 650nm nell‘intervallo 0,1-0,4.
4.2.3 Determinazione del potenziale redox di riduzione
Il potenziale redox del sistema Tioredossina-Tioredossina Reduttasi è
stato determinato a 60 °C misurando la variazione del segnale di
assorbanza a 340nm. Per effettuare tale esperimenti 10-36 µM di
SsTrxA1 sono stati miscelati con 50 µM di NADPH portando la
miscela ad un volume finale di 1ml in un tampone contenente 25mM
di MES/KOH e 2mM EDTA, pH 5.5. La reazione è iniziata in seguito
all’aggiunta di 2 µM di SsTrxR-B3. Quando il segnale di assorbanza si
è stabilizzato intorno un valore basso, è stato aggiunto alla miscela di
reazione un eccesso di NADP+ (1200 µM), e la reazione è stata
monitorata fino a quando il segnale di assorbanza ha raggiunto un
livello alto mantenendosi costante a 340nm. Il potenziale di riduzione
è stato calcolato dall’equazione di Nernst a partire dai valori di
concentrazione delle specie ridotte ed ossidate sia della tioredossine
107
che delle specie elettron-donatore. Per la risoluzione dell’equazione è
stato inoltre utilizzato come valore di potenziale di riduzione del
NADP+, quello calcolato a pH 5.5, risultato pari a -271 mV. Il
potenziale di riduzione riportato costituisce il valore medio calcolato
su 3-4 determinazioni e la varianza dei valori misurati in ogni singola
determinazione non ha superato il 4%.
4.2.4 Misura della termofilicità
Un campione contenente 50 µM SsTrxA1 in un tampone costituito da
100mM di fosfato di potassio, 2 mM di EDTA, pH 7.0, è stato
sottoposto a differenti temperature. A intervalli di tempo prestabiliti,
è stata misurata l’attività enzimatica residua utilizzando il metodo di
riduzione dell’insulina in presenza di DTT come specie elettron-
donatore. A partire dall’equazione At/Ao=-kt, è stata calcolata la
costante cinetica alla temperatura di inattivazione termica. Ao
rappresenta l’attività del campione che non ha subito trattamento
termico, At è l’attivtà misurata al tempo t di trattamento termico e k
è la costante cinetica del processo di inattivazione termica. L’energia
di attivazione del processo di inattivazione termica è stata calcolata
dalla curva di Arrhenius ottenuta riportando il logaritmo naturale
della costante cinetica in funzione della temperatura.
4.2.5 Cristallizzazione di SsTrxA1
La trattazione teorica della cristallizzazione di proteine è riportata in
dettaglio nell’Appendice I. Di seguito sono descritte brevemente le
condizioni di cristallizzazione di SsTrxA1 ricombinante ottenuto
attraverso la procedura appena descritta. Gli esperimenti di
cristallizzazione sono stati condotti a 293K usando i metodi di
cristallizzazione del microbath sott’olio e della diffusione in fase
108
vapore, hanging drop. Prove preliminari di cristallizzazione sono state
effettuate utilizzando un KIT reperibile in commercio contenente
soluzioni precipitanti a matrice sparsa (Crystal screen kits I and II,
Hampton Research). Cristalli singoli adatti per una analisi
cristallografica, sono stati ottenuti dalla sola forma troncata di
SsTrxA1, thioredoxin domain, utilizzando un intervallo di
concentrazione di proteina compreso tra 4-9 mg ml-1 e una soluzione
precipitante contenente PEG4000 30% (w/v), 0.2 M (NH4)SO4 (fig.
4.1). In Figura 4.1 è riportata un’immagine dei cristalli ottenuti nelle
condizioni di cristallizzazione sopradescritte.
Fig.4.1. Cristalli di SsTrxA1
4.2.6 Registrazione ed analisi statistica dei dati cristallografici di SsTrxA1
Dati di diffrazione sono stati registrati in house a 298 K, utilizzando
un CCD Saturn 944 collegato ad un generatore di radiazioni CuKα
MicroMax 007HF(RIGAKU) di lunghezza d’onda pari a 1.5418 Å. I
cristalli sono stati congelati aggiugendo alla soluzione tampone di
cristallizzazione glicerolo al 22% (v/v) per evitare processi di
109
decadimento radiattivo. I dati di diffrazione sono stati raccolti a 1.90
Å e processati mediante l’utilizzo del programma HKL2000.
Fig.4.2. Analisi statistica dei dati cristallografici di SsTrxA1.
4.2.7 Affinamento cristallografico di SsTrxA1
La struttura tridimensionale di SsTrxA1 è stata risolta utilizzando il
programma PHASER avvalendosi della struttura di SsTrxA2 come
modello di partenza, che presenta un’identità di sequenza del 40%.
E’ in corso l’affinamento cristallografico.
4.2.8 Determinazione della stabilità di SsTrxA1 mediante la tecnica spettroscopica del Dicroismo
circolare
La concentrazione delle proteine è stata determinata misurando
l’assorbanza a 280 nm, mediante uno spettrofotometro Jasco J-550.
110
Tutte le misure spettroscopiche sono state registrate con uno
spettropolarimetro Jasco J-810 provvisto di un sistema Peltier per il
monitoraggio della temperatura (modello PTC-423-S). Le curve di
denaturazione indotte da urea e da GuHCl, a temperatura costante,
sono state ottenute registrando la variazione del segnale CD a 222
nm a 20°C. La curva di denaturazione termica è stata registrata
misurando la variazione del segnale CD nell’intervallo 40-105°C a
λ=200 nm e a λ=222 nm con una velocità di scansione di 1°C min-1..
4.2.9 Esperimenti di denaturazione chimica
Entrambi i denaturanti urea e guanidinio idrocloruro (GuHCl) sono
stati acquistati come prodotti ultrapuri dalla ditta Sigma: il cloruro di
guanidinio come soluzione acquosa 8 M, mentre l’urea come solido.
Le soluzioni di urea sono state preparate solubilizzando una quantità
nota nella soluzione tampone, dopo aver essiccato il solido per circa
due ore sotto vuoto su P2O5. Le concentrazioni delle soluzioni sono
state determinate attraverso le misure degli indici di rifrazione (Pace
1986). E’ stato necessario preparare le soluzioni di urea al momento
dell’uso a causa dei fenomeni di decomposizione in ammonio e
cianato. Infatti, già dopo una settimana dalla preparazione della
soluzione lo ione cianato è presente in concentrazioni apprezzabili e
può modificare i gruppi amminici della proteina. Per la costruzione di
ogni curva di denaturazione sono state preparate e analizzate diverse
soluzioni con una concentrazione di proteina costante e una
concentrazione crescente di denaturante, compresa tra 0.0 e 9.6 M
di urea o tra 0.0 e 7.0 M di cloruro di guanidinio. In particolare, a 10-
20 µL della soluzione concentrata di proteina sono stati aggiunti
l’agente denaturante, quindi il tampone fosfato fino al volume finale
di 500 µL. Siccome elevate concentrazioni di urea e di cloruro di
guanidinio fanno variare il pH, per ogni singolo campione il pH è
111
stato corretto aggiungendo opportune quantità di soluzioni
concentrate di HCl oppure di NaOH. Inoltre i campioni sono stati
miscelati e incubati per una notte a 4 °C. Un’incubazione più lunga
produce segnali CD e di fluorescenza sovrapponibili.
4.3 Risultati
4.3.1 Proprietà biochimiche di SsTrxA1
La forma intatta di SstrxA1 purificata, come determinato dalla banda
presente su gel SDS, presenta un peso molecolare di circa 15 kDa
(forma full lenght). Esperimenti di purificazione effettuati omettendo
l’aggiunta di PMSF hanno consentito l’ottenimento soltanto della
forma troncata di SstrxA1, caratterizzata dal solo thioredoxin domain.
Questo dato è stato ulteriormente confermato da successivi
esperimenti di spettrometria di massa a cui sono state sottoposte
entrambe le forme ottenute. I risultati di questi esperimenti hanno
dimostrato che la forma intatta di SsTrxA1 presenta una massa
molecolare di 15517 Da, un valore coincidente con quello deducibile
dalla sequenza amminoacidica (15037 Da). Lo spettro di massa
misurato per la forma troncata di SstrxA1 invece presenta tre bande
distinte corrispondenti alle masse di 12421, 12580 e 12607 Da
coincidenti con le masse delle regioni compresa tra i residui Gly23-
Lys132, Lys24-Lys132, Lys25-Lys132. La massa molecolare
determinata attraverso cromatografia a scambio ionico, effettuata
per la forma troncata di SsTrxA1, mediante una colonna Superdex
75, ha invece rivelato un peso molecolare pari a 24 kDa. Il metodo
cromatografico è stato applicato in presenza dell’agente riducente β-
mercaptoetanolo. Questo dato confrontato con quanto rilevato per le
proteine mesofile, che sottoposte allo stesso esperimento,
presentavano un peso molecolare nettamente inferiore, indica che
SsTrxA1 (thioredoxin domain) è un omodimero e il legame covalente
112
tra i due monomeri non è costituito dal ponte disolfuro. L’attività di
SsTrxA1 è stata valutata tramite il metodo nefelometrico valutando la
riduzione di insulina in presenza o del DTT o della Tioredossina
Reduttasi. SstrxA1 è in grado di trasferire elettroni dal DTT
all’insulina determinando la sua riduzione seguita dalla conseguente
precipitazione. Il tempo in cui ha inizio la reazioni dipende
direttamente dal pH. Per una concentrazione di SsTrxA1 pari a 10µM
la riduzione dell’insulina ha inizio a 3.5 min e 7.0 min per valori di pH
pari 7.0 e 5.5. La stessa reazione è stata seguita in presenza di
SsTrxR(B3), e NADPH come elettron donatore. In questo caso
SstrxA1 ha catalizzato la reazione di trasferimento elettronico dal
NADPH all’insulina, ma la velocità d’inizio reazione è risultata più alta
rispetto a quella registrata in presenza del DTT. In presenza di DTT è
stato osservato che il massimo di attività di SstrxA1 si registra a pH
7, mentre in presenza di SsTrxR(B3) e NADPH, la massima efficienza
catalitica si svolge a pH acido, 5.5. Tuttavia benchè l’efficienza
catalitica di SstrxA1 sia inferiore a quella di SstrxA2, l’enzima
presenta una maggiore affinità per il substrato. Gli stessi esperimenti
condotti utilizzando la specie troncata di SstrxA1 (thioredoxin
domain), hanno rivelato che nonostante abbia la stessa attività
reduttasica della forma intatta, presenta un’attività ossidante
leggermente inferiore.
4.3.2 Il potenziale redox di SsTrxA1
Il trasferimento elettronico tra la Tioredossina e la Tioredossina
Reduttasi è un processo altamente reversibile. Tale osservazione
infatti è stata dimostrata aggiungendo alla miscela di reazione,
descritta nella sezione materiali e metodi, un eccesso di NADP+,
successivamente alla completa ossidazione del NADPH catalizzata
dalla Tioredossina Reduttasi SsTrxR(B3) a T=60°e pH 5.5. Con
113
questa procedura è stato possibile calcolare il potenziale di riduzione
dall’equazione di Nernst all’equilibrio. I valori del potenziale di
riduzione determinati per la forma intatta e la forma troncata di
SsTrxA1 sono risultati leggermente diversi, pari rispettivamente a -
149 mV e -160 mM. Ad ogni modo gli esperimenti condotti per
misurare il potenziale di riduzione oltre a dimostrare che il
trasferimento elettronico tra SstrxA1 e SsTrxR(B3) è altamente
reversibile, confermano l’appartenenza di SstrxA1 al sistema NADH-
Tioredossina Reduttasi.
4.3.3 Inattivazione termica di SsTrxA1
L’inattivazione termica di SsTrxA1 è stata valutata misurando l’attività
residua di riduzione dell’insulina mediante DTT, dopo aver esposto la
proteina purificata a diverse temperature. I risultati di tali
esperimenti hanno confermato che SsTrxA1 è un proteina molto
stabile, infatti una perdita significativa dell’attività enzimatica è stata
riscontrata soltanto dopo aver esposto l’enzima a trattamento
termico per diverse ore in un intervallo di temperatura compreso tra
92 e 99°C. E’ stato osservato che SsTrxA1, è leggermente meno
stabile di SsTrxA2, infatti a 92°C la due temperature medie di
inattivazione termica risultano pari a 20.5 h e 56.6 h per SsTrxA1 e
SsTrxA2. Il processo d’inattivazione dal punto di vista cinetico può
essere descritto da un’equazione di primo ordine. Tale risultato ha
consentito l’analisi dei dati attraverso l’utilizzo dell’equazione di
Arrhenius. Dalla retta di Arrhenius è stato infatti possibile
determinare l’energia di attivazione del processo che per SsTrxA1 è
risultata pari a 227 kJ/mol.
114
4.3.4 Determinazione della struttura cristallografica di SsTrxA1
Prove di cristallizzazione preliminari, effettuate su SsTrxA1 utilizzando
kit disponibili in commercio, hanno rivelato che esistono diverse
condizioni chimico-fisiche che determinano la formazione di cristalli di
SsTrxA1. Tuttavia tutti gli esperimenti che hanno mostrato un
apparente successo avevano un elemento in comune: la presenza del
polietilenglicole(PEG) come agente precipitante. Tuttavia in tutti casi
in cui sono stati ottenuti cristalli, sono stati osservati due differenti
fenomeni: in un primo caso la formazione di pochi cristalli singoli di
grosse dimensioni avveniva accanto a precipitati cristallini, in un
secondo caso era presente un solo cristallo singolo all’interno della
goccia contenete la soluzione precipitante. Le prove di
cristallizzazione sono state effettuate su entrambe le forme purificate
di SsTrxA1 ottenute, la forma intatta (full lenght) e la forma troncata
(thioredoxin domain). Tuttavia soltanto i cristalli ottenuti a partire
dalla forma troncata sono risultati quelli adatti per un analisi
cristallografica. I cristalli di SsTrxA1 (thioredoxin domain) si sono
formati da una soluzione contenente 30%(w/v) di PEG4000 e 0.2 M
di NH4SO4. La concentrazione di proteina era nell’intervallo 4-9mg ml-
1. In tre giorni i cristalli hanno raggiunto le dimensioni finali di
0.2×0.15×0.05mm3. i dati diffrazione sono stati raccolti a 1.90 A di
risoluzione utilizzando una sorgente convenzionale di radiazioni X.
Dal calcolo del coefficiente di Matthews è risultato in un caso la
presenza di tre monomeri di SsTrxA1 all’interno dell’unità
asimmetrica (Vm=2.63 Å3 Da-1; il contenuto di solvente pari al
53.2%), nell’altro caso, quattro monomeri (Vm=1.97 Å3 Da-1; il
contenuto di solvente pari al 39.6%). Le stesse condizioni di
cristallizzazioni utilizzando SsTrxA1 (full lenght) hanno determinato la
formazione di pochi cristalli singoli senza però alcun potere
diffrangente. Tale risultato ha avvalorato l’ipotesi che la presenza del
115
frammento N-terminale, che presenta di norma uno stato non
foldato, ha un impatto negativo sul processo di crescita di cristalli
ordinati.
La struttura tridimensionale di SsTrxA1 (forma troncata) è stata
risolta con il metodo della sostituzione molecolare, utilizzando come
modello di partenza la struttura di SsTrxA2. La struttura preliminare
ottenuta mediante l’utilizzo del programma PHASER sembra
confermare che nell’unità asimmetrica vi siano tre monomeri. E’ in
corso L’affinamento cristallografico di SsTrxA1.
4.3.5 Analisi della stabilità termica
La stabilità termica di SsTrxA1 è stata analizzata mediante lo studio
delle variazioni dello spettro CD a λ=200 nm e λ=222 nm
nell’intervallo 40-105°C. Queste due lunghezze d’onda sono scelte
per ottenere informazioni sull’effetto della temperatura sia sulle
regioni ad α-elica ([θ]220) che β-sheet ([θ]200) della proteina. In
queste condizioni, il processo di denaturazione termica non provoca
alcuna variazione conformazionale, in quanto la proteina mantiene il
suo stato foldato anche se sottoposta per diverse ore a temperature
superiori ai 105°C. Questa osservazione sperimentale conferma
l’elevata termostabilità di SsTrxA1.
190 200 210 220 230 240 250
-10
-5
0
5
10
15
20
25
[ ϑ] (
deg
cm2 dm
ol-1)1
0-3
wavelenght (nm)
Fig.4.3. Caratterizzazione spettroscopica di SsTrxA2: spettro CD lontano UV.
116
4.3.6 Denaturazione chimica
Per valutare ulteriormente la stabilità confomazionale di SsTrxA1,
sono stati effettuati esperimenti di denaturazione chimica utilizzando
due diversi agenti denaturanti, GuHCl e urea. In particolare sono
stati registrati gli spettri CD di SsTrxA1 a temperature ambiente per
miscele diverse proteine-agente denaturante (urea e cloruro di
guanidinio) a concentrazione variabile (2-8 M). L’analisi degli spettri
CD ha rivelato che in presenza dell’ urea l’enzima conserva la sua
stabilità anche per concentrazioni di agente denaturante superiori a 8
M. In presenza di GuHCl, l’enzima comincia a perdere il suo stato
foldato a per valori di concentrazione di GuHCL superiori a 4 M. Il
dato conferma ulteriormente l’elevata termostabilità dell’enzima che
è infatti in grado di mantenere il suo stato foldato anche in presenza
di concentrazioni discrete di un agente denaturante forte.
190 200 210 220 230 240 250
-10
-5
0
5
10
15
20
25
[ϑ] (
deg
cm2 dm
ol-1)1
0-3
wavelenght (nm)
0M GuHCl 2M 3M 4M 5M 6M 7M
Fig.4.4. Spettro CD registrato nel lontano UV della proteina nativa trattata con soluzioni
diversamente concentrate di cloruro di guanidinio (GuHCl)
4.4 Conclusioni
Gli studi condotti su SsTrxA1 hanno consentito in via preliminare di
rilevare le differenze e le similitudini che l’enzima presenta nei
117
confronti della sua omologa SsTrxA2. In particolare sia gli studi
biochimici che strutturali hanno dimostrato che i due enzimi anche se
appartengono allo stesso organismo e sono coinvolte nel medesimo
processo redox, presentano proprietà differenti. In particolare gli
esperimenti condotti per valutare le loro caratteristiche biochimiche
hanno rivelato, che i due enzimi hanno due diverse strategie per
raggiungere l’efficienza catalitica. Entrambe le proteine sono in grado
di ridurre l’insulina in presenza del DTT come specie elettron-
donatore. Inoltre gli esperimenti condotti per misurare l’attività
reduttasica usando NADPH/SsTrxR(B3), hanno confermato che sia
SsTrxA1 che SsTrxA2 appartengono al sistema redox NADPH-
Tioredossina Reduttasi. Inoltre per entrambe l’attività catalitica
dipende dal pH, infatti raggiungono il massimo dell’attività a pH 7
quando viene utilizzato il DTT, a pH 5.5 in presenza di
NADPH/SsTrxR(B3). Tuttavia l’ esperimento in presenza di
NADPH/SsTrxR(B3) ha rivelato che mentre SsTrxA1 raggiunge un
elevata efficienza catalitica attraverso una maggiore affinità per il
substrato, SsTrxA2 possiede una velocità di catalisi più elevata.
Ulteriori differenze sono state riscontrate nella determinazione del
potenziale redox. Risulta infatti che SstrxA1 ha un potere ossidante
leggermente inferiore rispetto a SsTrxA2.
Per quanto concerne la stabilità, è stato osservato che entrambe le
proteine sono altamente stabili anche se sottoposte per diverse ore a
temperature superiori ai 90°C. Inoltre anche se mostrano lo stesso
comportamento nel processo di inattivazione termica, ossia
mantengono la loro struttura nativa senza alcuna transizione
conformazionale a seguito di un trattamento termico prolungato,
SsTrxA1 risulta essere leggermente meno stabile di SsTrxA2.
Per quanto concerne la struttura di SsTrxA1, i primi risultati
confermano che nonostante presenta diverse similitudini con SsTrxA2
a livello di struttura secondaria, si differenzia notevolmente. La
stessa ipotesi trova conferma nel diverso comportamento mostrato
dai due enzimi durante i processi di cristallizzazione. La formazione
118
dei cristalli di SsTrxA1 ha richiesto un tempo leggermente più lungo
rispetto a SsTrxA2, e anche se i cristalli erano di dimensioni maggiori
e presentavano una morfologia regolare, spesso si sono dimostrati
inadatti per analisi cristallografiche. Probabilmente l’enzima data la
sua minore stabilità rispetto SstrxA2, più spesso ha incontrato
maggiori difficoltà nel processo di formazione di cristalli ordinati.
Le indagini strutturali attualmente in corso su SsTrxA1 si prefiggono
di ottenere ulteriori chiarimenti sulle proprietà funzionali-strutturali
dell’enzima, ed eventualmente individuare se SsTrxA1 ha escogitato
diverse strategie per l’adattamento alle alte temperature.
119
CAPITOLO 5
CONCLUSIONI E PROSPETTIVE
La caratterizzazione molecolare e strutturale del sistema NADH-
Tioredossina Reduttasi all’interno di S.solfataricus, che costituisce
l’obiettivo del presente progetto, è stata avviata non soltanto per
dare un significato razionale all’apparente ridondanza riscontrata in
tale organismo, ma soprattutto per determinare il ruolo svolto dalle
diverse molecole che partecipano a tale processo.
Nel genoma di S.solfataricus sono state identificate due tioredossine
(SsTrxA1 e SsTrxA2) e in base all’omologia di sequenza tre diverse
Tioredossine Reduttasi SsTrxR(B1), SsTrxR(B2) e SsTrxR(B3).
Inizialmente è stata caratterizzata la Tioredossina Reduttasi,
SsTrxR(B3), della quale in questo lavoro sono stati condotti studi
cristallografici che hanno reso nota la sua struttura tridimensionale.
Gli esperimenti biochimici effettuati sugli enzimi precedentemente
menzionati all’interno di questo paragrafo, hanno consentito di
conoscere il ruolo svolto dai tre enzimi oggetto del presente studio
SsTrxR(B3), SsTRxA1 e SsTrxA2.
Infatti i risultati raggiunti hanno dimostrato che SsTrxA1 e SsTrxA2
sono i reali substrati di SsTrxR(B3).
Al contrario invece ancora non è stata chiarita la funzione biologica di
SsTrxR(B2) che non è in grado di catalizzare il trasferimento
elettronico dal NADPH alla Tioredossina.
Per quanto concerne SsTrxR(B1) sembra che non possa classificarsi
come Tioredossina Reduttasi, poiché pur se presenta un attività
NADH-ossidasi FAD dipendente, non contiene il motivo strutturale
CXXC.
Tutti i cinque enzimi sono stati ottenuti attraverso espressione
eterologa e l’ottenimento di un ammontare appropriato di
120
SsTrxR(B3), SsTRxA1 e SsTrxA2 in forma purificata, ha consentito di
effettuare con successo esperimenti di cristallizzazione.
La determinazione cristallografica della struttura terziaria di
SsTrxR(B3), SsTRxA1 e SsTrxA2 ha permesso di rilevare similitudini e
differenze con proteine omologhe appartenenti ad altre specie, e in
accordo con i risultati ottenuti dagli studi spettroscopici effettuati con
la tecnica del dicroismo circolare, di individuare i determinanti
strutturali che conferiscono l’elevata stabilità alle alte temperature.
La determinazione cristallografica e spettroscopica di SstrxR(B3) ha
mostrato che l’ enzima presenta proprietà specifiche, che attestano
alcune differenze in termini strutturali-funzionali, rispetto alle
proteine omologhe mesofile.
SstrxR(B3) possiede due differenti attività, un attività Tioredossina
Reduttasica e un attività NADH-ossidasica. Tuttavia per quanto
concerne l’attività Tioredossina Reduttasica, l’enzima sembra avere
due diversi substrati Trx, SsTrxA1 e SsTrxA2, e PDO.
La caratterizzazione strutturale di SstrxR(B3) ha mostrato che a
differenza di quanto osservato in struttura note di tioredossine
reduttasi da eucarya-bacteria, la proteina nativa presenta un diverso
modo di legare il cofattore FAD. Infatti l’anello isoallossazinico è
molto più esposto e tale osservazione potrebbe spiegare l’attività
aggiuntiva presentata dall’enzima, ossia la capacità di legare e di
ossidare il NADPH.
La stessa ipotesi trova conferma da ulteriori studi strutturali condotti
su di un mutante di SsTrxR(B3), ottenuto sostituendo il residuo di
cisteina 147, con un residuo di alanina, C147A. Infatti il mutante, che
presenta una larga cavità in prossimità del sito attivo, ha un attività
marginale NADPH-ossidasica. In altre parole una maggiore
esposizione del cofattore FAD, rende disponibile l’anello
isoallossazinico della molecola per altre reazioni.
121
Gli esperimenti di denaturazione condotti sull’enzima hanno poi
rivelato interessanti proprietà che concernono l’elevata stabilità di
SsTrxR(B3).
In particolare la denaturazione dell’enzima in presenza di basse
concentrazioni dell’ agente denaturante, cloruro di guanidinio, GuHCl,
monitorata tramite registrazione di spettri CD a temperatura
ambiente, ha dimostrato che le interazioni elettrostatiche presenti
nella struttura interna, largamente contrastate nelle condizioni
sperimentali sopra descritte, hanno un ruolo fondamentale nei
processi di stabilizzazione termica.
In particolare le analisi strutturali condotte su SsTrxR(B3), hanno
dimostrato la presenza di un certo numero di coppie ioniche
all’interfaccia tra i due domini che caratterizzano la molecola, il
NADPH domain e il FAD domain.
Le interazioni elettrostatiche coinvolgono quattro residui
