Diagnostica di laboratorio della tubercolosi:
le antiche certezze e le nuove frontiere
Dr. Chiara Agrati, PhD
Laboratorio di Immunologia cellulareINMI L. Spallanzani
La diagnosi immunologica
dell’infezione tubercolare
Infezione tubercolare latente (2 miliardi)Infezione tubercolare latente (2 miliardi)
Infezione subclinica con bacilli tubercolari senza
segni clinici, batteriologici o radiologici di malattia
manifesta. Tipicamente si tratta di individui con
intradermoreazione tubercolinica positiva ed un Rx
torace normale, che possono essere contatti di un
precedente caso di tubercolosi.
Infezione latente e malattia attiva
Infezione tubercolare attiva (8 milioni/anno)Infezione tubercolare attiva (8 milioni/anno)Stato di malattia manifesta dal punto di vista clinico, batteriologico e/o radiologico.
High Innate
immunityMTB clearence NO Infection
Innate
immunity
Adaptive
immunity
Latent
Infection
Innate
immunity
Defective
Adaptive
immunity
Disease <10%
Controlled
>90%
Reactivation
<10%
Risposta immunologica e esito
dell’infezione
Gran parte del “successo” di Mtbcome agente patogeno è dovuto allasua capacità di interferire conpraticamente ogni meccanismobattericida del macrofagoutilizzando tale tipo cellulare comeun cavallo di “Troia” per sfuggireal riconoscimento immune
• Infezione attiva: a) Microbiologica (Microscopia, Coltura e Metodi molecolari)
b) Radiologica
• Infezione latentea) Test immunologici che valutano la risposta immune
(Mantoux, IGRA)
• Immunità umorale - Riscontro in circolo di anticorpi
• Immunità cellulo-mediata - Riscontro in circolo di
cellule T specifiche per il patogeno
Diagnosi
ANTIGENE
LINFOCITI
RESPONSIVI
MECCANISMO
EFFETTORE
BATTERI EXTRA-CELLULARI MICROBI INTRA-CELLULARI
ALL’INTERNO DI UN MACROFAGO
LINFOCITA B LINFOCITA TLINFOCITA T
ANTICORPI
SECRETI
ELIMINAZIONE
DEI BATTERI
MICROBI INTRA-CELLULARI
IN UNA CELLULA INFETTATA
ATTIVAZIONE DEL MACROFAGO
UCCISIONE DEI MICROBILISI DELLA CELLULA
INFETTATA
IMMUNITA’ CELLULO-MEDIATAIMMUNITA’ UMORALE
Immunità umorale e cellulo-mediata
• CD4: - Induzione dei meccanismi battericidi del macrofago
- Rimozione del blocco della maturazione del fagosoma e della fusione del fagolisosoma
- aumento delle molecole costimolatorie
- Produzione di citochine infiammatorie
• CD8:- Lisi delle cellule infette mediata da citochine
- Lisi delle cellule infette mediata da granulolisine
Il ruolo dei linfociti T
Il principale obiettivo dei test immunologici è di identificare le
infezioni tubercolari latenti
Ma non discriminano tra infezione latente e attiva
1) Mantoux, introdotta nel 1891
2) IGRA: Interferon-gamma release assay (dal 2001)2a) Quantiferon TB Gold2b) Quantiferon TB In tube2b) QTSPOT-TB
I test immunologici
• E’il più vecchio test diagnostico ancora in uso-1891: filtrato di brodo di coltura (reazione febbrile)-1934 PPD (reazione cutanea di ipersensibilità ritardata)-Oggi: inoculazione intradermica di 5UI di PPD e lettura dopo 48-72h.
–il soggetto che ha immunità specifica produce una papula (lettura dopo 48-72 h)
– si misura l’infiltrato, non l’eritema
La Mantoux
• Utile per predire la TBC attiva
• Il trattamento dei soggetti Mantoux positivi
riduce drasticamente il rischio di passaggio alla
tubercolosi attiva
• Basso costo
• Non richiede l’intervento del laboratorio
Vantaggi della Mantoux
• legati a cross-reazione con altri micobatteri
• legati a vaccinazione con BCG
• effetto booster
• legati alla somministrazione
• legati alla lettura
falsi positivifalsi positivi
Problemi di ordine praticoProblemi di ordine pratico
• 2 visite (inoculo e lettura
• 30% dei test rimane senza lettura
Limiti della Mantoux (1)
– malattie degli organi
linfoidi (HD, linfomi…)
– età (neonati, anziani)
– infezione di MTB recente
– stress (chirurgia, GVHD…)
• legati alla tubercolina
– improprio stoccaggio, diluizione…
• legati alla somministrazione– quantità insufficiente di
antigene somministrato
– ritardo dopo la
preparazione della siringa
• legati alla lettura
– inesperienza del lettore – errori consci o inconsci
• legati al soggetto testato
– infezioni
– disturbi metabolici
– fattori nutrizionali
– farmaci (corticosteroidi,
agenti immunosoppressivi…)
falsi negativifalsi negativi
Vantaggi della Mantoux (2)
Cut-off di positività per gruppi di rischio
≥ 5 mm ≥ 10 mm ≥ 15 mm
- HIV positivi
- contatti recenti di TB
- rx compatibile con TB
- trapiantati e immunosoppressi
- immigrati di recente da aree ad alta prevalenza
- tossicodipendenti
- residenti e operatori di ambienti a rischio
- silicosi, diabete mellito, IRC, leucemie, carcinomi…
- soggetti senza fattori di rischio
Lettura della Mantoux: cut-off
IGRA: Interferon gamma release assay
3 principali modifiche rispetto alla Mantoux:
a) test in vitroin vitro
b)Antigeni utilizzati: per la stimolazione vengono utilizzati gli antigeni ESATESAT--66 e e CFPCFP--1010, , specifici per specifici per MTB ed assenti nel BCGMTB ed assenti nel BCG
c)c)Hanno un Hanno un controllo positivo controllo positivo di immunocompetenzadi immunocompetenza
I test IGRA
La scelta degli antigeni
• La Manotux si base sull’inoculazione di PPD (purified
proteic derivative) che è presente in molti altri micobatteri
ambientali e anche nella vaccinazione con BCG.
Gli IGRA utilizzano antigeni codfificati in una regione
genica (RD-1) che manca nel BCG e in quasi tutti i
micobatteri ambientali. I principali di questi anti geni sono:
– ESAT-6 (early secretory antigenic target 6)
– CFP-10 (culture filtrate protein 10)
IGRA: antigeni specifici
> specificità
Test in vitro
Vantaggi degli IGRA
Nessun effetto booster
Specificità elevata (antigeni ESAT-6 e CFP-10 codificati in una regione genica (RD1)
Non influenzati dalla vaccinazione con BCG
Praticità: occorre solo un prelievo di sangue e non èrichiesta la collaborazione del paziente
Interpretazione oggettiva (fornisce un dato di Laboratorio, positivo o negativo,rispetto ad un “cut-off” universale per tutti i soggetti, indipendentemente dal fattore di rischio cui sono esposti)
Disponibilità di un controllo mitogeno (QFT-TB GOLD) che permette di verificare la risposta immunitaria del paziente.
Eliminano il ricorso a trattamenti non necessari
Limiti degli IGRA
• I campioni di sangue devono essere processati entro
8-16 ore
• Esistono meno dati sull’utilizzo di questi test in alcune
popolazioni di soggetti come immunocompromessi,
bambini e nei follow up seriali
Sensibilità
NON esiste un gold standard
1)Proporzione di test positivi in soggetti con TB attiva2)Stima della sensibilità usando il gradiente di esposizione
Specificità
NON esiste un gold standard
Il Quantiferon è chiaramente più sensibile negli individui vaccinati
Quale test è più opportuno utilizzare ?
E’ preferibile usare Mantoux
E’ preferibile usare IGRA
1) Nei bambini al di sotto dei 5 anni di età .Alcuni esperti suggeriscono che per aumentare la sensibilità sarebbe meglio farli entrambi.
1) Persone ad alto rischio di non presentarsi alla 2 visitaper la lettura (tossicodipendenti, senza tetto, etc);
2) Persone vaccinate con BCG ;3) Nei follow-up per evitare l’effetto booster
=
Paragonabili
1) Contatti recenti con persone con TB attiva o sospetta TB attiva. Sul
TST ci sono più dati ma c’è rischio effetto Booster; per gli IGRA meno
dati sui tempi di conversione
2) Screening occupazione per persone a rischio (HCWs). Problema
delle conversioni/reversioni
Quale test è più opportuno utilizzare ?
Mantoux + IGRA
+
1) Test iniziale negativo:
1a) gruppi ad alto rischio di infezione e progfresisone (HIV, bambini < 5
anni);
2a) sospetto fondato di infezione e si desidera conferma
2) Test iniziale positivo:
2a) servono ulteriori evidenze per convincere pazienti;
2b) grupi a bassissimo rischio
3) Nei casi in cui test IGRA è indeterminato/borderline/etc .