Elementi di Virologia
VIRUS e VIRIONI – caratteri generali
Semplici unità acellulari (1), formate da una o più molecole di
DNA o RNA (2) racchiuse in involucro proteico (talvolta
ulteriormente avvolte da involucro membranoso contenete anche lipidi e
carboidrati).
La riproduzione avviene solo all’interno di cellule viventi: sono
parassiti endocellulari obbligati (3).
VIRUS e VIRIONI – caratteri generali
Semplici unità acellulari (1), formate da una o più molecole di
DNA o RNA (2) racchiuse in involucro proteico (talvolta
ulteriormente avvolte da involucro membranoso contenete anche lipidi e
carboidrati).
La riproduzione avviene solo all’interno di cellule viventi: sono
parassiti endocellulari obbligati (3).
Ma:
loro semplicità non deve ingannare!
malattie, tante e molte difficili da curare!
molteplicità di studi genetici e molecolari!
VIRUS e VIRIONI – caratteri generali
In tutti i virus abbiamo nucleocapside costituito da un acido
nucleico avvolto da/in un capside proteico di struttura icosaedrica,
elicoidale o complessa. I capsidi si (auto)assemblano formando tra
le unità costituenti (protomeri) legami non covalenti
I genomi virali sono più differenziati ed eterogenei di quelli
procariotici ed eucariotici e possono consistere in un filamento
singolo o doppio di DNA o di RNA.
I filamenti di acidi nucleici possono essere in forma lineare,
circolare o possono assumere entrambe le forme
VIRUS e VIRIONI – caratteri generali
VIRIONE: particella virale metabolicamente inerte, non esplica né
respirazione né biosintesi. E’ la struttura attraverso la quale il
genoma virale è trasportato dalla cellula che lo ha prodotto ad
altra dove l’acido nucleico verrà nuovamente introdotto dando
inizio allo stato intracellulare
VIRUS: forma, stadio del ciclo intracellulare, ove avviene
replicazione, prima di nuove copie del genoma e poi delle
componenti di rivestimento
Il virus riprogramma le funzioni metaboliche e biosintetiche
dell’ospite, finalizzandole alla sua moltiplicazione
VIRUS – dimensioni
Numero di studi e di evidenze in esplosione
- importanza
- facilità di studio
- tecniche
Dimensioni:
da 10 a 300-400nm
es: poliovirus 28nm
poxvirus 250nm
A parte quelli di più grandi dimensioni, è sempre necessario
microscopio elettronico per visualizzarli
VIRUS – dimensioni
Virus di grandi dimensioni (circa 1 micron e forma a goccia che li
fa rassomigliare ad alcuni tipi di batteri), il cui genoma è anche di
grandi dimensioni (circa 2 Megabasi):
- Mimivirus (2003)
- Megavirus (2011)
- Pandoravirus (2013)
- Pithovirus (2014)
Raffronto fra le dimensioni dei cenomi di virus, eucarioti, batteri e archea. (E. Pennisi/Science/AAAS)
VIRUS: ACIDI NUCLEICI
Eccezionale flessibilità, e molta diversità dimensionale (da 1x106
Dalton 3-4 proteine a 1x108 Dalton più di 100 proteine)
DNA ss
ds (maggior parte di virus batterici)
RNA ss* filamento + (es TMV, polio, sarcoma Rous)
filamento – (es rabbia, morbillo, influenza)
ds*maggior parte di piante, e in generale > parte di RNA virus
VIRUS – origine
Mistero…
Due le ipotesi più accreditate, più una che segue la scoperta dei
megavirus
1) originati, almeno i virus più complessi (poxvirus, herpesvirus) da
cellule di ridotte dimensioni, probabilmente procarioti parassiti
andati incontro a fenomeni successivi di semplificazione
strutturale e fisiologica e sempre più dipendenti da ospite
(evoluzione retrograda)
Ma: molto diversi da procarioti!
assenza di forme intermedie
VIRUS – origine
2) Acidi nucleici svincolatisi parzialmente dalle cellule e diventati
particolarmente indipendenti ma anche infettanti (contengono
infatti sequenze simili a plasmidi e trasposoni). Attorno a questo
acidi nucleici le proteine si sarebbero spontaneamente
assemblate con modalità e strutture particolarmente rispondenti
a criteri di economia e robustezza.
Questa ipotesi prevede più eventi indipendenti che darebbero
ragione di varietà sia di forme che di ospiti infettati
Inoltre, si sta di recente ipotizzando loro ruolo centrale nella
transizione da mondo a RNA a mondo a DNA sono loro che hanno
evoluto DNA per proteggerlo da ribonucleasi
3) la maggior parte dei geni dei
Pandoravirus non compare in alcun
database ipotesi che i virus abbiano
avuto origine da una stirpe cellulare
primitiva totalmente diversa da
Archea, Bacteria e Eukarya nome
per questo nuovo raggruppamento:
“Truc”, acronimo di:
Things Resisting Uncomplete
Classification
VIRUS – origine
VIRUS – struttura
NUCLEOCAPSIDE: costituente ultimo, sempre presente
Costituito da un acido nucleico + involucro proteico che lo
racchiude (CAPSIDE).
Eventualmente può essere presente un pericapside o involucro
In principio si riteneva fosse tutto qua, niente enzimi, ma non è
così, se ne riscontrano spesso, associati a capside o involucro,
quando presente
Maggior parte coinvolti nel processo di replicazione dell’acido
nucleico (trascrittasi inverse, ecc), ma anche di supporto
nell’infezione (neuraminidasi, lisozima)
VIRUS – struttura
Divisione rispetto ai capsidi (in generale, a struttura):
1) Icosaedrici
2) Elicoidali
3) Con pericapside (anche definiti pleomorfi)
4) Complessi (spesso possiedono porzioni caudali, o pareti
complesse e stratificate)
VIRUS – struttura
VIRUS – struttura
I capsidi sono formati da uno o più tipi di subunità proteiche
protomeri, che una volta formati ed esposti a condizioni
appropriate possono interagire ed aggregarsi, organizzandosi
in capsomeri autoassemblaggio (nessuna necessità
esterna). Questo è vero in particolare per capsidi icosaedrici ed
elicoidali massima economia di sequenze geniche
I capsidi di virus complessi necessitano invece del supporto di
fattori proteici specifici per l’assemblaggio
VIRUS a struttura icosaedrica
Una delle forme che natura predilige (insieme a elica), modo
estremamente efficiente di racchiudere uno spazio con
struttura regolare
In generale, si associano protomeri
pentamerici ai vertici di icosaedro
esamerici formano lati e facce dei triangoli
VIRUS a struttura elicoidale
Struttura molto simile a quella di altri tubi costituiti da pareti
proteiche (es flagelli). Sembra che lunghezza sia determinata
da lunghezza dell’acido nucleico
TMV: protomeri di un solo tipo,
si aggregano con andamento
elicoidale tubo rigido.
Materiale genetico si avvolge
a spirale all’interno della
cavità che rimane
VIRUS (a struttura elicoidale) con pericapside
Virus influenzali: strutture elicoidali ma flessibili ripiegate in
pericapside
VIRUS con pericapside
Solitamente virus animali; traggono origine da membrane di
cellula ospite per quanto riguarda frazione lipidica e carboidrati
Proteine del pericapside sono invece
codificate dal genoma virale,
disposte spesso con proiezione
esterna (es virus influenzali),
definite spicole o peplomeri.
Sono elemento di classificazione
e possono partecipare a
processo di adesione
VIRUS con pericapside
Virus dell’influenza:
1) enzima neuroaminidasi (NA)
agevola virus nella penetrazione
dei tessuti, in particolare lo
strato mucoso dell’epitelio
respiratorio
2) Emoagglutinine (HA)
consentono legame a membrane
di eritrociti emoagglutinazione
VIRUS complessi I
poxvirus:
i più grandi, visibili a microscopio ottico.
Struttura interna molto complessa ed esterna a forma ovoidale, o di
mattone
VIRUS complessi II
Fagi (es pari che infettano E. coli)
Testa: icosaedro allungato,
contenente acido nucleico
(quasi sempre DNAds)
Colletto
Stilo (cavo) rivestito da
Guaina
Piastra basale con o senza
Spine caudali
Fibre caudali, si dipartono da ogni
angolo della piastra
VIRUS complessi II
Fagi lambda e maggior parte di dispari: no guaina e piastra, fibre
caudali rudimentali
VIRUS – purificazione
Quattro metodi
1. Centrifugazione differenziale e/o in gradiente di densità
VIRUS – purificazione
Quattro metodi
1. Centrifugazione differenziale e/o in gradiente di densità
2. Precipitazione con solfato d’ammonio concentrato (o PEG)
3. Denaturazione dei contaminanti (virus solitam più stabili)
Temperatura o pH; solventi organici (es cloroformio)
4. Digestione enzimatica (virus solitam più resistenti)
tripsina e ribonucleasi
VIRUS – metodi di conta/carica virale
Generalmente il n totale di virioni è 1-2 milioni di volte il n delle
unità infettanti (almeno nei virus animali)
Conta diretta al microscopio elettronico con aggiunta sferette latex
VIRUS – metodi di conta/carica virale
Metodi indiretti
saggio delle placche PFU
saggio emoagglutinazione (per alcuni virus), permette di
calcolare quantità relative
LA REPLICAZIONE VIRALE
Delbruck e Ellis, 1939 curva di crescita a ciclo unico o “one
step”, poiché il rilascio delle particelle avviene nella
maggior parte dei casi simultaneamente
LA REPLICAZIONE VIRALE
PERIODO DI LATENZA = intervallo minimo di tempo necessario
per riproduzione e liberazione dei virus
All’interno del periodo di latenza distinguiamo
ECLISSI: fase in cui l’acido nucleico è “nudo” entro l’ospite. Se la
cellula ospite viene distrutta in questo momento il virione
non esiste più come entità infettiva
MATURAZIONE: sintesi ed impacchettamento; il numero di
particelle virali mature aumenta notevolmente ma nessuna
viene rilasciata*
*n° di virioni rilasciati è spesso indicato come dimensione dello
scoppio
LA REPLICAZIONE VIRALE - fasi
1. Attacco (o adsorbimento) del virione alla cellula ospite
2. Penetrazione (o iniezione) del virione o del suo acido nucleico
3. Sintesi
4. Assemblaggio
5. Rilascio lisi
gemmazione
esocrescita
LA REPLICAZIONE VIRALE – fasi
LA REPLICAZIONE VIRALE – difese dell’ospite
In generale, gli animali possiedono sistema immunitario che
spesso evita direttamente l’attacco, ma questo non è possibile
per i microrganismi
Tutti possono invece avere sistemi per distruzione del genoma
virale, e soprattutto i batteri endonucleasi di restrizione e
modificazione (ospite però difende suo DNA con modificazioni
specifiche nei siti di taglio soprattutto per enzimi su DNAds)
I virus però a loro volta spesso si proteggono
proteine che inibiscono enzimi
glicosilazioni
metilazioni (solitamente dopo replicazione)
LA REPLICAZIONE VIRALE - fasi
3. Sintesi di acidi nucleici e proteine:
il virus deve, a prescindere dalla natura del suo genoma:
fare mRNA che servono per proteine specifiche virali
replicare genoma nella forma specifica
Baltimore (1975 Nobel per retrovirus e trascrittasi inversa):
sistema di classificazione basato su relazione del genoma virale
con suo mRNA (con polarità positiva) divisione in 7 classi
LA REPLICAZIONE VIRALE - fasi
3. Sintesi di acidi nucleici:
Classificazione di Baltimore
LA REPLICAZIONE VIRALE - fasi
3. Sintesi di acidi nucleici:
Classificazione di Baltimore
Classe I DNA ds: segue leggi di ospite
Classe II DNA ss+: prima si forma
filam complementare perché RNA
pol possa lavorare e per sintesi
nuovi genomi, poi filamento -
viene scartato
Classe VII DNA ds ma si replica
attraverso intermedio a RNA
trascrittasi inversa, mentre per
fare mRNA usano meccanismo
classico
LA REPLICAZIONE VIRALE - fasi
3. Sintesi di acidi nucleici:
Classificazione di Baltimore
Tutti i virus a RNA necessitano di
RNA pol RNA dipendenti virus specifiche
Classe IV RNA ss+: direttamente
mRNA, codificante anche per
RNA replicasi filamento – che
usa come stampo per nuovi
mRNA e per genomi
Classe III e V RNA ss- e ds:
portano RNA pol RNA dipendente
già in forma proteica, introdotta
in ospite con RNA
Classe VI RETROVIRUS – RNA ds:
virus animali a RNA che si
replicano con intermedio a DNA
LA REPLICAZIONE VIRALE – i retrovirus
Tutto catalogato? NO!
Ci sono virus a RNAss con mezzo filamento + e
mezzo - AMBIVIRUS!
LA REPLICAZIONE VIRALE - fasi
3. Sintesi di acidi nucleici e proteine:
Proteine virali possono essere suddivise in:
1. Precoci: tipicamente enzimi, sintetizzati in piccole quantità.
Alcune sono deputate ad arrestare trascrizione e traduzione
dell’ospite
2. Tardive: generalmente componenti strutturali del virione,
prodotte in grande quantità
LA REPLICAZIONE VIRALE - fasi
Conseguenze di infezioni da virus animali:
Infezioni citocide:
1. Inibizione sintesi acidi nucleici e proteine (herpes e
adenovirus)
2. Danno a lisosomi
3. Alterazioni profonde a membrane plasmatiche (es morbillo)
4. Accumulo tossico proteine virali
5. Corpi inclusi
6. Distruzione cromosomi (es herpesvirus)
7. Trasformazione in cellule tumorali
LA REPLICAZIONE VIRALE - fasi
Conseguenze di infezioni da virus animali:
Infezioni croniche:
Es: epatite B, herpes simplex, varicella zooster, citomegalovirus
Si manifestano subito, poi sintomi spariscono perché virus cessa
riproduzione e rimane latente, ma possono ricominciare a
manifestarsi
Infezioni da virus lenti:
Segni e sintomi clinici possono impiegare anni per manifestarsi,
ma poi lo fanno in maniera estremamente invalidante
Es: forme di morbillo non manifeste 5-10 anni
panencefalopatite sclerosante subacuta
LA REPLICAZIONE VIRALE –virus implicati in insorgenza di tumori umani
Epstein-Barr virus linfoma di Burkitt
carcinoma nasofaringico
Hepatitis B virus cancro del fegato
Hepatitis C virus cancro del fegato
Human herpesvirus 8
HIV
sarcoma di Kaposi
human papillomavirus cancro della cervice
HTLV-1 and HTLV-2 leucemia
165-180 e 250-265 dC: Impero Romano epidemia di morbillo e
vaiolo ( Nuovo Mondo nel 1500!); non potevano averli neppure
lontanamente visti, ma immaginati sì!
inizi 1700, Lady Wortley Montagu cerca di portare, con scarso
successo, tecnica empirica di immunizzazione praticata in Turchia da
donne che facevano contrarre ai figli forma lieve di vaiolo
1798: pubblicazione di Jenner, con 23 vaccinazioni di successo
contro vaiolo effettuate con estratti da lesioni provocate dalla forma
bovina. Causa o agenti ancora non chiari, ma tecnica ha successo (?
tutti gli agenti patogeni vengono indicati come virus, anche
Pasteur lo fa!)
VIRUS e VIRIONI – excursus storico
1884 Chamberland contribuisce a scoperta dei virus con
l’invenzione dei filtri di porcellana (porosa) per batteri
1892 Ivanowskij per primo descrive malattia indotta anche dopo
filtrazione di estratti malattia del mosaico del tabacco; definisce
“tossina” l’agente eziologico
1898-1900: stessa identificazione da parte di Beijerinck, che
meglio definisce l’agente come “entità non batterica in grado di
moltiplicarsi solo in cellule vegetali viventi, ma in grado di
sopravvivere per tempi prolungati a stato di disidratazione”. Da
questo momento nuove evidenze
afta epizootica
febbre gialla
VIRUS e VIRIONI – excursus storico
~1910 Ellerman e Bang (Copenhagen): leucemia aviaria
Rous (New York): sarcoma maligno dei polli
alcuni tumori possono essere provocati da virus!
1915 Twort: anche i batteri possono essere infettati dai virus
Dimostrato definitivamente da d’Herelle: Shigella dyssenteriae su
piastra + sospensione virale aree circolari chiare contenenti virus
e cellule lisate saggio delle placche
concetto e termine di batteriofagi
1935: Stanley riesce a definire struttura cristallografica del TMV e
quindi a determinarne la natura chimica
VIRUS e VIRIONI – excursus storico
1940: Bawden e Pirie riescono a scindere particelle in frazione
proteica e acido nucleico